Системы клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков

• Автор: Белжеларская, Светлана Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 168 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Введение

1.2. Вирусные векторы для переноса и экспрессии генов в клетках эукариот

1.3. Бакуловирусы

1.3.1. Биология бакуловирусов

1.3.2. Молекулярная биология бакуловирусов

1.4. Бакуловирусные системы экспрессии (БЭС) рекомбинантных белков в клетках эукариот

1.4.1. Системы экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов

1.4.2. Получение функционально активных рекомбинантных белков с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых
1.4.3. Получение вирусоподобных частиц и вакцин в клетках насекомых е использованием бакуловирусной системы экспрессии
1.4.4. Бакуловирусы - средство введения и экспрессии гетерологичных генов
у млекопитающих
1.4.5. Клеточные линии млекопитающих, чувствительные к бакуловирусной
трансдукции
1.4.6. Эффективность бакуловирусной трансдукции
1.4.7. Механизм взаимодействия бакуловируса с клетками млекопитающих
1.4.8. Доставка и экспрессия гетерологичных генов в клетки млекопитающих
in vivo
1.5. Заключение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ (УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА)
2.1. Материалы
2.2. Условия эксперимента (Методы)
2.2.1. Условия эксперимента к разделу 3.
2.2.2. Условия эксперимента к разделу 3.
2.2.3. Условия эксперимента к разделу 3.
2.2.4. Условия эксперимента к разделу 3.
2.2.5. Условия эксперимента к разделу 3.
2.2.6. Условия эксперимента к разделу 3.6...................................47-48'
2.2.7. Условия эксперимента к раздел)1 3.
2.2.8. Условия эксперимента к разделу 3.8;..................................49-54’
2.2.9. Условия эксперимента к разделу 3.9:
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХОБ СУЖДЕНИЕ
3.1. Изучение структурной организации геномов РНК-содержащих фитопатогенных вирусов, представляющих интерес для биотехнологии, вируса штрнховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и Х-вируса картофеля (ХВК)
3.1.1. Структурная организация генома вируса штриховатой мозаики
ячменя ВШМЯ1......................................: 61 ’
3.1.1.1. Анализ геномных РНК разных штаммов вируса методом олигонуклеотидного картирования
3.1.1.2. Получение бактериальных клонов, содержащих последовательности генома^ ВШМЯ и их анализ
3.1.2. Первичная структура и организация генома Х-вируса картофеля (ХВК)
3.2. Использование бактериальной системы селекции на основе Bacillus subtilis для отбора мутантных рибозимов, эффективно функционирующих в физиологических условиях
3.2.1. Получение штаммов НК012 и НК014 В. subtilis и их характеристики
3.2.2. Сравнение способности роста штаммов НК012* и НК014* В. subtilis на основе низкокопийной плазмиды рНК002* при различной концентрации эритромицина,
тилозина, антибиотиков и IPTG
3.3. Создание новых векторных конструкций, содержащих делеционные варианты промотора кислой фосфатазы РН05, для экспрессии и секреции репортерных генов
в клетках дрожжей У. cerevisiae
3.3.1. Получение набора фрагментов, содержащих регуляторные элементы транскрипции гена репрессибельной кислой фосфатазы дрожжей S. cerevisiae, кодируемой
геном РН
3.3.2. Использование четырех делеционных вариантов промотора (-31, -36, -18, -12) гена РН05, для исследования уровня экспрессии HBsAg в дрожжах под контролем сконструированных плазмид

3.3.3. Использование делеционных вариантов промотора гена РН05 для>изучения влияния лидерного пептида кислой фосфатазы, а также различных условий
культивирования дрожжевых клеток на синтез гормона роста (ГР) человека
3.4. Роль серотоииновой системы в реакции различных типов клеток на
стрессорные* сигналы
3.4.1. Конструирование рекомбинантных ДНК, содержащих ген серотонинового рецептора 5НТ1 на основе растительных векторов экспрессии TMV pAG-GC2 и

3.4.1.1 Конструирование плазмиды pAGC-SER-
3.4.1.2. Конструирование плазмиды pAGC-SER-
3.4.1.3. Конструирование плазмиды pAGC-SER
3.4.2. Экспрессия и активность рецептора серотонина в составе гибридных
молекул
3.4.2.1‘. in vitro транскрипция рекомбинантной ДНК pAGC-SERl
3.4.2.2. Экспрессия рецептора 5НТ1с в составе гибридных молекул в листьях
табака
3.4.2.3. Экспрессия рецептора 5НТ1с на поверхности клеточной мембраны ооцитов Xenopus laevis
3.4.3. Клонирование и экспрессия кДНК гена серотонинового рецептора мыши в клетках насекомых
3.4.3.1. Конструирование рекомбинантной векторной ДНК pFastBac-5HTl с, содержащей кДНК рецептора серотонина мозга мыши
3.4.3.2. Получение бакмидной ДНК с последовательностью гена рецептора 5НТ1с
3.4.3.3. Получение рекомбинантного бакуловируса RBHT-5HTlc (bv-5HTlc), продуцирующего рекомбинантный рецептор серотонина 5НТ1с в зараженных клетках насекомых
3.4.3.4. Экспрессия кДНК гена рекомбинантного белка рецептора серотонина 5НТ1с в
инфицированных клетках насекомых
3.5. Экспрессия генов хорионического гонадотропного гормона человека и рецептора CD4 в клетках насекомых, с использованием бакуловирусной системы экспрессии
3.5.1. Конструирование плазмидных ДНК на основе бакуловирусных векторов, содержащих кДНК а- и (3-субъедшшц хорионгонадотропина (ХГ) человека и рецептора CD4 ВИЧ
3.5.1.1. Конструирование экспрессирующих плазмидных ДНК pAcYM- а-ХГ и pAcYM-

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ (УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА)
2.1. Материалы
Материалы. В работе были использованы dNTP, АТР фирм “Serva” и “Boehringer [ 32P]dNTP получены из Физико-энергетического института (Обниниск) и опытного завода НПО «ГИПХ» (Санкт-Петербург). Использованы компоненты бактериальных сред «Difco», а также другие препараты фирмы “Serva”, “Sigma” и “Bio-Rad Laboratories”. Отечественные реактивы использовали высшей категории качества.
Используемые бактериальные штаммы:
Штаммы E.coli: JM109, DH5a, RR1, TG1, XLI, DH10BAC (“Invitrogen” США)
Штаммы В. subtilis: НК001, НК005, IS75, BD430 предоставлены Ф. Крамером и Д. Дубноу (Национальный ^Институт Здоровья, Нью-Йорк, США)
Используемые клеточные линии:
Клеточные линии насекомых: Spodoptera frugiperda SJ9; Trichoplusia пі Ні5 (High FiveCells, BTI-TN-5B1-4). (“Invitrogen” США)
Клеточные линии млекопитающих: COS-7 (фибробласты зеленой мартышки), НЕК293 (эмбрион почки человека) и Huh7 (гепатоцеллюлярная карцинома человека) (“Invitrogen” США).
Вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) любезно предоставлен М.Д. Саммерсом (Texas А&М University, College Station, Texas 77843-2475, АС 409-845-2516). Ферменты
ДНК-полимераза I E. coli; ДНК-лигаза фага Т4, РНК-лигаза фага Т4, Т4-полинуклеотидкиназа, (“Amersham”); (“Boeliringer” ФРГ); фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Escherichia coli,
Панкреатическая рибонуклеаза (“SigmaPHKa3a U2, РНКаза Physarum М (“Boeliringer”, ФРГ); Рибонуклеаза TI (“Sankyo”, Япония);
Обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц (Dr. Beard, США);
Нуклеаза Si, проназа, щелочная фосфатаза (“Boehringer ” ®PT,“Worthington” США); Терминальная рибоаденилаттрансфераза (“Invitrogen” США);
Рестрикционные эндонуклеазы (MBI Fennentas, Литва; НПО «СибЭнзим», Россия; “Amersham”Англия)
Ферменты использовали в соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве Маниатиса и соавт. [131]
Антитела