Структурно-функциональный анализ энхансерных и инсуляторных систем регуляции транскрипции

• Автор: Акопов, Сергей Борисович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 203 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

Регуляторные элементы генома

2.1. Инсуляторы

2.1.1. Функции инсуляторов

2.1.2. Белки, обеспечивающие действие инсуляторов

2.1.3. Механизмы блокирования энхансеров

2.1.3.1. Модель ловушки (promoter decoy)

2.1.3.2. Модель отслеживания (tracking)

2.1.4. Нейтрализация эффекта положения
2.1.5. Инсуляторы и S/MAR-элементы
2.1.6. Регуляция функционирования инсуляторов
2.1.7. Локус-контропирующие последовательности
2.2. Белок CTCF и его роль в крупномасштабной регуляции активности генома позвоночных
2.2.1. CTCF как многофункциональный регулятор
2.2.1.1. CTCF и гены, ассоциированные с раком
2.2.1.2. CTCF и развитие: регулятор основных регуляторов?
2.2.2. CTCF и функционирование генома
2.2.2.1. Геномное распределение сайтов связывания CTCF
2.2.2.2.CTCF опосредует взаимодействие между регуляторными сайтами на больших расстояниях
2.2.3. Взаимодействие CTCF с другими белками
2.2.3.1. CTCF и когезинопый комплекс
2.2.4. CTCF и повторяющиеся элементы генома
2.2.5. Регуляция гена CTCF
2.2.5.1. Возможные механизмы регуляторной активности CTCF
2.3. Ретроэлементы
2.3.1. Краткая история исследования ретровирусов и ретроэлементов
2.3.2. Жизненный цикл и строение ретровирусов, синтез LTR
2.3.3. Возникновение, структура и классификация ретроэлементов
2.3.4. Структура эндогенных ретровирусов
2.3.5. Семе иство HER V-K(HML-2)
2.3.6. Функциональные элементы в составе LTR
2.3.7. Биологическая роль LTR
2.3.7.1. Экспрессия вирусных генов
2.3.7.2. Влияние LTR на экспрессию клеточных генов
2.3. 7.3. Защита от повторного заражения
2.3.7.4. Придание пластичности геному
2.3.8.Белковые факторы транскрипции, способные связываться с LTR
3. Материалы и методы
3.1. Материалы
3.2. Методы
3.2.1. Стандартные методики
3.2.2. Культивирование клеток
3.2.3. . Трансфекция клеток
3.2.4. Трансфекция клеток электропорацией
3.2.5. Позитивно-негативная селекция последовательностей потенциальных инсуляторов
3.2.6. Получение вирусных частиц и инфицирование клеток

3.2.7. Определение титра вирусных частиц
3.2.8. Селекция клеток на среде с гснетицииом G 418
3.2.9. Получение библиотеки фрагментов ДНК локуса FXYD5-COX7A хромосомы 19 человека
3.2.10. Радиоактивное мечение праймеров
3.2.11. Очистка меченой ДНК
3.2.12. Определение активности люциферазы
3.2.13. Фиксация и окрашивание клеток с помощью Coomasie Blue
3.2.14. Картирование последовательностей на геноме
3.2.15. Метод двумерного EMSA
3.2.16. Иммунопреципитация хроматина
3.2.17. Двумерный электрофорез с ультрафиолетовой сшивкой
3.2.18 Приготовление ДНК-аффинного носителя
3.2.19. Фракционирование ядерного экстракта наДНК-аффинной колонке
3.2.20. Фракционирование ядерного экстракта методом аффинной элюции
3.2.21. Обработка гелей, гидролиз трипсином и экстракция пептидов
3.2.22. Анализ триптических пептидов при помощи масс-спектрометрии
4. Результаты и обсуждение
4.1. Стратегия идентификации энхансер-подобных элементов в протяженных областях сложных геномов
4.1.2. Экспериментальная идентификация и картирование энхансер-подобных элементов в локусс FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека
4.1.3. Создание векторных конструкций для селекции энхансер-подобных элементов
4.1.4. Клонирование и селекция энхансер-подобных элементов
4.1.5 Анализ отобранных потенциальных энхансерных фрагментов.
4.1.6.Способность отобранных фрагментов связываться с клеточными белками
4.1.7. Способность отобранных фрагментов активировать минимальный промотор с репортерным геном
4.1.8. Анализ расположения потенциальных энхансеров в геноме. Построение карты расположения энхансеров
4.1.9. Функциональный анализ активности потенциального энхансера “U2AF1L4"
4.2. Стратегия экспериментального поиска ипсуляторов в протяженных областях сложных геномов
4.2.1. Система для экспериментального поиска ипсуляторов
4.2.2.Анализ расположения ипсуляторов в геноме
4.2.3 Функциональный анализ ипсуляторов
4.3. Эихансер-блокирующая активность CTCF-связывающих последовательностей
4.4. Идентификация и картирование CTCF-связывающих последовательностей ■ в глобиповом локусс птиц
4.5.Анализ функциональной архитектуры LTR семейства HERV-K(HML-2) и его взаимодействий с регуляторными компонентами клетки
4.5.1.Характеристика LTR HERV-K
4.5.2.Промоторная активность LTR
4.5.3.Негативный регуляторный элемент (НРЭ)
4.5.4.Энхаисерная активность LTR
4.5 5.Клеточные белки, специфически связывающиеся с LTR 11ERV-K
4.5.6.Связывание белков другими участками LTR
4.5.7. Связывание белков с негативным регуляторным элементом (NRE)

4.5.8.Идентификация белков, потенциально ответственных за энхансерную активность
ВТК. НЕЯУ-К
4.5.9.Выделение и идентификация белков ЕЛЬвИ!, 2 и 3, специфически связывающихся с иг 11 НЕКУ-К
5. Выводы
6. Список цитированной литературы
7.Приложения

нокдауне гена CTCF с использованием антисмысловых конструкций наблюдалось ингибирование дифференцировки клеток К-562 (ToiTano et al., 2005; Manavathi et al., 2011) и апоптотическая гибель клеток в клеточных линиях рака молочной железы (Docquier et al., 2005). Снижение экспрессии CTCF, обусловленное siRNA, приводило к снижению экспрессии генов МНС II класса (Majumder et al., 2006). Приведенные выше данные свидетельствуют о многофункциональной природе CTCF, и в то же самое время показывают, что CTCF не существенен для роста клеток в культуре или пролиферации опухолевых клеток.
CTCF регулирует экспрессию гена Рахб, кодирующего высококонсервативный транскрипционный фактор, который имеет важное значение в развитии центральной нервной системы, включая развитие глаза (Osumi et al., 2008). Нокдаун CTCF у трансгенных мышей усиливает транскрипцию Рахб, тогда как суперэкспрессия CTCF подавляет его транскрипцию, возможно за счет разобщения промотора Рахб и его энхансера (Li et al., 2004; Fang et al., 2014).
Истощение материнского CTCF в ооцитах мыши приводит к нарушению регуляции транскрипции многих генов, мейотическим дефектам в яйцеклетке и эмбрионе. Авторы пришли к заключению, что CTCF играет существенную роль в раннем эмбриональном развитии (Wan et al., 2008; Moore et al., 2012).
Приведенные выше данные кажутся противоречивыми, однако следует принимать во внимание существенное различие между генным нокаутом, ведущим к полному исчезновениюСТСР из всех клеток организма и условным генным нокаутом или нокдауном транскрипта в соматической ткани. В последних случаях может существовать депо стабильных белков, которое, вероятно, имеется в случае CTCF. Это депо может быть достаточным для поддержания нескольких клеточных делений, например, в случае материнского CTCF в яйцеклетке (Wan et al., 2008; Singh et al., 2012). К сожалению, данные, позволяющие оценить содержание белка CTCF в различных клетках, в настоящее время отсутствуют.
В целом приведенные результаты указывают на существенную роль CTCF в развитии млекопитающих. По-видимому, функции CTCF включают (но не