Транскрипционная и посттранскрипционная регуляция экспрессии гена рецептора гормона роста человека

• Автор: Орловский, Игорь Вячеславович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Механизмы котранскрипционного сопряжения процессинга РНК.

1. Введение. «Гипотеза сопряжения»

2. С-концевой домен большой субъединицы РНК-полимеразы II

3. Код CTD

3.1. Г ипотеза CTD-кода

3.2. Фосфорилирование остатков серина в CTD

3.3. Фосфорилирование тирозина-1 и треонина

3.4. Динамическое фосфорилирование аминокислотных остатков

CTD в транскрипционном цикле

3.5. Изомеризация пролинов в CTD
4. Заключение. Перспективы развития. 31 И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Химические реактивы
2. Вода
3. Нуклеиновые препараты
4. Препараты белков (ферментов)
5. Бактериальные штаммы, компетентные клетки. Работа с бактериальными культурами и индивидуальными клонами
6. Радионуклидные препараты. Введение метки в ДНК и РНК
7. ДНК
8. Секвенирование
9. РНК
10. Картирование сайтов старта транскрипции
11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
12. Ядерный матрикс. Связывание фрагментов ДНК с ядерным матриксом in vitro
13. Культивируемые клеточные линии человека. Трансфекция

14.Определение промоторной активности по уровню экспрессии люциферазы и «маркерного» фермента в лизатах трансфицированных эукариотических клеток.
15. Компьютерные программы и электронные ресурсы.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Структура гена hGHR. Функциональная карта кодирующей области и проксимальной 5’-НТО. Картирование основных элементов гена hGHR.
2. Анализ in silico локуса гена hGHR.
2.1. Общая характеристика и регуляторные области.
2.2. Характеристика структуры хроматина.
3. Характеристика нетранслируемых областей гена hGHR.
3.1. Характеристика 5’-НТО. Картирование 5’-нетранслируемых экзонов гена hGHR.
3.2. Картирование сайтов старта транскрипции в 5’-НТО.
3.3. Характеристика З’-НТО гена hGHR.
3.4. Изучение взаимодействия участков нетранслируемых областей с ядерным матриксом in vitro.
4. Картирование и изучение активности in vitro основных промоторов гена GHR человека.
4.1. Промотор Р1, специфический для взрослой печени.
4.2. Общетканевой промотор Р2.
4.2.1. Характеристика промоторной области.
4.2.2. Изучение влияния короткой открытой рамки считывания (кОРС), расположенной в 5'-нетранслируемом экзоне V2 гена GHR, на экспрессию репортерного гена люциферазы.
4.3. Другие промоторы генов GHR.
4.3.1. Картирование предполагаемого промотора РЗ.
4.3.2. Изучение предполагаемых промоторных районов экзонов V5 и V9.
5. Нетранслируемый «экзон» V6.

5.1. Картирование V6 в хромосоме 11 человека.
5.2. Клонирование хромосомного фрагмента гена hMOGAT2.
5.3. Анализ экспрессии V6 в тканевых и клеточных РНК.
5.4. Анализ экспрессии гена hMOGAT2 в некоторых тканях человека и клеточных линиях.
5.5. Идентификация антисмыслового транскрипта в локусе гена hMOGAT2.
5.6. Картирование промотора в 5’-области V6.
5.7. Гипотетический механизм образования химерного транскрипта V6 в результате транс-сплайсинга.
6. Изучение экспрессии гена hGHR в некоторых человеческих тканях, культивируемых клеточных линиях и образцах опухолей.
6.1. 5’-нетранлсируемая область гена hGHR.
6.1.1. Идентификация новых 5’- нетранслируемых экзонов гена hGHR.
6.1.2. Экспрессия 5’-нетранслируемых экзонов гена hGHR в клеточных линиях.
6.2. Транслируемая область гена hGHR.
6.2.1. Экспрессия мРНК hGHR в некоторых тканях и клеточных линиях.
6.2.2. Исследование экспрессии мРНК гена hGHR в некоторых клеточных линиях.
6.2.3. Анализ экспрессии форм MPHKhGHR в образцах опухолей и в клеточных линиях опухолевого происхождения.
6.2.4. Гипотетический механизм образования и возможная роль укороченной формы мРНК гена hGHR.
6.3. Изучение влияния суперэкспрессии компонентов хроматин-ремоделирующего комплекса SWI/SNF на экспрессию и альтернативный сплайсинг мРНК hGHR.
7. Полиморфизм и мутации в гене hGHR.
7.1. Полиморфизм области экзона 3 гена hGHR.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности основных олигонуклеотидов для амплификации нетранслируемых и кодирующих экзонов гена ЬОНК. (Орегоп, Германия).
Название Нуклеотидная последовательность Длина
VI 5 ’-gattgagaatgactgatttgggagggat-3 ’
V2 5'-cggaacccgcgctctctgat-3’
V3a 5 ’-ccaggagaccttggaagggacag-3 ’
V4 5 ’-ggggaatgagtagcaaagatggattaagt-3 ’
V5 5 ’-agatcaaattaaagcaaaccttactggcc-3 ’
V6 5 ’-ccggaaccacaaggtcagcatc-3 ’
V7 5 ’-ggccttcagttcagcagcagag-3 ’
V8 5 ’ -gctatgacagcacgtatgagcctg-3 ’
V9B 5 ’-cgttggcaccgatggaactgg-3 ’
V10 5 ’-cattattactgtgcatggagattagaagcc-3 ’
2R 5 ’-aaaagcatcacttgatcctgccagt-3 ’
4F 5 ’-attcaccaagtgccgttcacctg-3 ’
6R 5 ’-agggcaatgggtggatctggtt-3 ’
8F 5 ’-tgggctaacagtgatgctatttgtattct-3 ’
10R 5 ’-tctagctcaataaattcaacccaagagtca-3 ’
Таблица 2. Нуклеотидные последовательности основных олигонуклеотидов для амплификации фрагментов области У6/ЬМООАТ2 (Орегоп, Германия).
Название Нуклеотидная последовательность Длина
395 5 ’-gcccggaaccacaaggtcagcatcatca-3 ’
396 5 ’-aagagaagcctgtgctctcagtgcacaggt-3 ’
v6 5 ’-ccatggagtcctggcagtcggagcctt-3 ’
398 5’-tacattgcgggcttccacccccatggagtc-3’
399 5 ’-agtcggagcctttgccaacctgtgcactga-3 ’
400 5 ’-gatcactgagtctccgttgtggaa-3 ’
401 5 ’-gtcacatcagaaaaggagagtgctgct-3 ’
402 5 ’ -acgaagccctttcggttccgcagtaa-3 ’
403 5 ’-ttaaaccaaagctgtactggaagaca-3 ’
241 5 ’-ttaagaattcagccagcatcaagtctgtggca-3 ’
242 5’-ttaagaattcacctcaggtcacccacc cgc-3’
243 5’-ttaagaattctaacccatctctagaat atg-3’
244 5’-ttaagaattcagattcagctgcttggc aca-3’
V6genF 5’-ttaaggtaccaatattaaaattcatgaaaatattgct -3’
V6genR 5’- ttaagaattccatgcattgagctagataggtt -3’
4. Препараты белков (ферментов). Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы): Hind III, BamH I, EcoR I, Not I, Sal I, Smal, Xhol, Ndel, Bglll, Ncol (Promega, США); BamH I, Kpn I, Mlu I, Bgl II, Pspl24BI (SacI), SphI, Sfil,