Обнаружение опухолей на основе идентификации экзосомальных белков в сыворотке крови

• Автор: Никитина, Инна Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Роль экзосом в процессе канцерогенеза
1.1.1. Общая характеристика эукариотических микропузырьков
1.1.2. Роль экзосом в процессах опухолевой
прогрессии и метастазирования
1.1.3. Подавление систем наследственного
и приобретенного иммунитета
1.1.4. Активация процессов васкуляризации и ангиогенеза
1.1.5. Анализ протеома опухолевых экзосом
1.2. Методы иммуноанализа белков
1.2.1. Общий обзор
1.2.2. Радиоиммуноанализ (РИА)
1.2.3. Иммуно-ферментный анализ (ИФА)
1.2.4. Иммуно-ПЦР
1.2.5. Электрохимический анализ
1.2.6. Коиммунопреципитация хроматина (СЫР)
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Антисыворотки
2.2. Коммерческие антитела и их конъюгаты
2.3. Коллекция образцов

2.4. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом и микровезикул
2.5. Экстракция белков
2.6. Электрофорез белков в ПААГ
2.6.1. Трис-глициновая система
2.6.2. Трис-трициновая система
2.7. Окрашивание гелей
2.7.1.Окрашивание гелей Кумасси
2.7.2.Окрашивание гелей солями серебра
2.8. Вестерн-блот анализ
2.9. Дот-блот анализ
2.10. Разделение продуктов ПЦР
2.11. Выделение сывороточных экзосом
2.11.1. Выделение экзосом ультрацентрифугированием
2.11.2.Выделение экзосом с использованием препарата Ехоцшск
2.12. Иммунопреципнтация
2.12.1.Иммунопреципитация дефензина 5 из образцов
сыворотки крови
2.12.2.Иммунопреципитация экзосом из образцов сыворотки крови
2.13. Получение рекомбинантных фрагментов белков
2.14. Масс-спектрометрический анализ
2.15. Получение моноклональных антител
2.16. Очистка моноклональных антител
2.17. Получение высокоаффинных поликлональных антител
2.18. Очистка поликлональных антител
2.19. Иммуно-ПЦР
2.19.1. Синтез праймеров
2.19.2.Конъюгация антител и ДНК-репортера .ГУ/ с
магнитными микрошариками
2.19.3. Иммуно-ПЦР в прямом формате
2.19.4. Иммуно-ПЦР в сэндвич формате
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Сбор коллекции образцов
3.2. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой
кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых
экзосом
3.3. Получение рекомбинантных фрагментов отобранных белков
3.4. Получение высокоаффинных поликлональных антител к
фрагментам рекомбинантных белков
3.5. Получение моноклональных антител
3.6. Разработка нового формата иммуно-ПЦР для обнаружения рака
толстой кишки
3.6.1. Очистка экзосом из образцов сыворотки крови

^ Биотин ^
БИ0ТИНЛГ СТА- СТА А %
“■* белок А °
Т Ковалентная
“1. Л“'"
Антиген Антиген Антиген
Рисунок 7. Способы конъюгации антител с ДНК-репортером: биотинилирование ДНК с использованием гибридного белка (А), биотинилирование антител и репортера с последующим добавлением стрептавидина (Б) и химическая пришивка репортера к антителам (В). СТА -стрептавидин.
Второй способ (т.н. «универсальный иммуно-ПЦР») предполагает введение биотиновой метки, как в конец ДНК-репортера, так и в детектирующее антитело (в этом случае присоединение биотина к антителу происходит по остаткам лизина и аргинина, что вызывает частичную инактивацию детектирующих антител) [97]. Конъюгация происходит в результате добавления в смесь детектирующих антител и ДНК-репортера стрептавидина. Одна из модификаций этого протокола предполагает образование больших надмолекулярных комплексов, включающих несколько молекул стрептавидина на одно антитело [98]. Это позволяет несколько повысить чувствительность теста, хотя взаимодействие антиген-антитело в этом случае несколько затруднено вследствие пространственного экранирования. Часть иммуно-ПЦР протоколов такого типа основана на использовании липосом, что позволяет более чем в сто раз повысить