Изучение роли белка Sgf11 в транскрипции и экспорте мРНК из ядра

• Автор: Гурский, Дмитрий Ярославович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Общие механизмы транскрипции
1.1. Приближенная общая схема транскрипционного цикла
2. Комплексы, изменяющие структуру хроматина
2.1. Комплексы АТФ-зависимого ремоделинга хроматина
2.2. Связь комплексов ремоделинга хроматина
2.3. Комплексы, химически модифицирующие хроматин
2.4. Динамическая система модификаций белков, сопровождающих транскрипционнный цикл
2.5. Гистонацетилтрансферазы. SAGA - подобные комплексы
2.5.1. Комплексы Gcn5/PCAF. Структура белков семейства Gcn5 и PCAF
2.5.2. Фракции весом 2MDa
2.5.3. Фракции весом 0.7 MDa. АТАС - комплекс
2.5.4. Функции гистонацетилтрансферазных Gcn5/PCAF комплексов
3. Гнстоиацстнлтрансфсразный комплекс SAGA. Роль в процессе биогенеза мРНП частиц
3.1. Активационные модули SAGA. FlAT-модуль. Роль в инициации и элонгации транскрипции
3.2. DUB-модуль SAGA и его роль в инициации и элонгации транскрипции
3.3. Связь модулей SAGA в процессе транскрипции
4. Транскрипция и экспорт мРНП частиц
4.1. Комплекс белков, связывающих Кэп (СВС)
4.2. От транскрипции к экспорту. THO/TREX комплекс
4.3. Компоненты мРРПТ частиц, связывающие процессинг и экспорт
4.4. Хеликаза Sub2p/UAP56
4.5. Адаптеры и рецепторы экспорта мРНП. Связь с транскрипцией
4.5.1 Фактор экспорта Mex67-Mtr2/TAP-pl5
4.5.2. Yralp
4.5.3. SR-белки
4.6. Позиционирование генов к ядерной поре и экспорт
4.6.1. Нуклеопорины и комплекс ядерной поры
4.6.2. TREX-2/AMEX комплекс. Позиционирование генов к ядерной поре
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ОБЪЕКТ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы
1.1. Программное обеспечение, базы данных
1.2. Штаммы и вектора Е
1.3. Эукариотические клеточные линии и вектора, использованные в работе
1.4. Среды для культивирования клеток
1.5. Приборы и реактивы
1.6. Линии!), melanogaster
1.7. Ферменты
1.8. Антитела
1.9. Праймерные олигонуклеотиды
1.10. Генно-инженерные конструкции
2. Методы
2.1. Работа с ДНК
2.1.1. Приготовление компетентных клеток
2.1.2. Лигирование
2.1.3. Трансформация бактерий
2.1.4. Выделение плазмидной ДНК (мчнипреп, щелочной лизис)
2.1.5. Обработка ДНК рестриктазами
2.1.6. Гель-электрофорез ДНК и очистка ДНК

2.1.8. Секвенирование ДНК
2.1.9. Трансформация S2 клеток
2.1.10. Выделение геномной ДНК из мух и из культуры клеток
2.2. Работа с РНК
2.2.1. Выделение РНК
2.2.2. ОТ-ПЦР
2.2.3. Получение двуцепочечной РНК
2.2.4. РНК-интерференция
2.3. Гибридизация in situ
2.3.1. РНК in situ гибридизация с СуЗ-oligo-dT праймером
2.3.2. РНК in situ гибридизация с ДНК-зоидом к индивидуальному гену
2.4. Работа с белками
2.4.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
2.4.3. Экспрессия рекомбинантных белков в 82-клетках
2.4.3. Получение антител
2.4.4. Очистка антител
2.4.5. Белковый гель-электрофорез
2.4.6. Вестерн-блот анализ
2.4.7. Разведение популяции, сбор эмбрионов D. melanogaster. Выделение эмбрионального ядерного экстракта и белковых экстрактов из культуры эукариотических клеток
2.4.8. Хроматография и фракционирование эмбрионального экстракта
2.5. Иммуноокрашивание
2.5.1. Иммуноокрашивание S2 клеток
2.5.2. Иммуноокраишвание полтпепных хромосом
2.6. Иммунопреципитация
2.9.1. Иммунопреципитация белков из ядерного эмбрионального экстракта
2.9.2. Иммунопреципитация белков из клеточного лизата
2.9.3. Иммунопреципитация хроматина (СЫР)
2.9.4. Иммунопреципитация мРНП

РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Изучение взаимодействия Sgfl 1 с компонентами SAGA DUBm
2. Sgfl 1 привлекается в промоторную область гена hsp70 при активации транскрипции, и его привлечение зависит от РНК
3. Sgfl 1 взаимодействует с мРНК индивидуальных генов и координирует общий экспорт мРНК
4. Sgfl 1 присутствует в ядерной и цитоплазматической фракции 52-клеток, колокализуется с комплексом ядерной поры и взаимодействует с комплексом общего экспорта мРНК АМЕХ
5. Sgfl 1 присутствует в составе нескольких комплексов, выделенных из ядерного экстракта эмбрионов дрозофилы, и ассоциирован с белком комплекса, связывающего S'-Кэп
6. СЬр80 необходим для привлечения Sgfl 1 в промоторную область гена hsp70
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

PCAF i
hs {

Рисунок 2. Строение белков Gcn5 и PCAF у позвоночных, D. melanogaster и дрожжей [55, 85].
Схематическая организация доменов каталитических субъединиц Gcn5 и PCAF у человека (hs; Homo sapiens), курицы (gg; Gallus gallus), zebrafish (dr; Danio rerio), pufferfish (tn; Tetraodon nigroviridis), дрозофилы (dm; Drosophila melanogaster) и дрожжей (sc; Saccharomyces cerevisiae). Серым цветом выделен домен гомологии PCAF (PCAF-FID), черным цветом указан каталитический ацетилтрансферазный домен (АТ), теневая легенда соответствует бромодомену (Bromo). Указан домен убиквитинлигазы (ЕЗ) PCAF у человека. Справа указана степень гомологии, номера аминокислотных остатков обозначены сверху.
2.5.2. Фракции весом 2MDa.
Первые выделенные из человеческих клеток Gcn5-содержащие комплексы были похожи по составу на уже известный SAGA комплекс дрожжей массой 2 МДа [156]. У млекопитающих обнаружено два близких гомолога Gcn5: Gcn5L и PCAF. Они входят в состав трех SAGA-подобных комплексов: PCAF, TFTC (TBP-Free-TAF-Containing или TAF-conTaining Complex) и STAGA (SPT3-TAF9-Gcn5/PCAF Acetyltransferase) весом около 2 МДа) [157, 158]. TFTC и STAGA чрезвычайно похожи и различаются наличием дополнительного набора TAFs у TFTC [159]. Все обнаруженные у различных организмов комплексы содержат либо Gcn5, либо PCAF в качестве каталитических HAT субъединиц. В составе HAT’s имеется несколько основных групп белков, изначально классифицировавшихся следующим образом: каталитические ацетилтрансферазные
субъединицы Gcn5, PCAF; белки группы Spt, необходимые, как считают, для обеспечения