Изучение регуляции транскрипции генов бактериофагов во время инфекции хозяйской клетки

• Автор: Климук, Евгений Иванович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

Оглавление
Обозначения и сокращения
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Цели работы
Научная новизна
Практическая значимость работы
Публикации и апробация работы
Литературный обзор
Введение
Транскрипция прокариот
Транскрипционные стратегии бактериофагов
Бактериофаг Т7
Бактериофаг фКМ V
Бактериофаг N4
Бактериофаг X
Бактериофаг Т4
Бактериофаг <р29
Бактериофаг ХрЮ
Бактериофаг Т5
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и бактериофаги
Питательные среды и антибиотики
Плазмидные вектора
Получение препаратов бактериофагов
Инфекция клеток бактериофагом
Определение одиночного цикла развития фага
Выделение ДНК бактериофагов
Условия проведения полимеразной цепной реакции
Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
Обработка амплифицированных фрагментов и вектора рестриктазами
Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
Лигирование ПЦР-продукта и вектора
Трансформация бактериальных клеток
Выделение плазмидной ДНК
Получение амбер-мутанта бактериофага Т5 по гену Т5
Получение матриц для транскрипции in vitro
Реакция транскрипции
Электрофорез РНК в ПААГ с мочевиной
Получение РНК фага Т5
Нозсрн-блот гибридизация
Получение радиоактивно-меченых олигонуклеотидов
Метод удлинения праймера
5’-RACE (Rapid Amplification of CDNA Ends)
Клонирование и экспрессия гена Т5
Очистка (His)6-pcKOM6nHaiiTHbix белков хроматографией на №2+-хслатном носителе
Клонирование и экспрессия генов, кодирующих gp2-noflo6nbie белки фагов
Pseudomonas
Ренатурация белка
Электрофорез белков в денатурирующих условиях в ПААГ
Выделение РНКП из клеток, инфицированных бактериофагом
Очистка препарата РНКП на гепарин-сефарозс
Приготовление образцов и MALDI-масс-спектрометрия белков
Определение концентрации белка
Радиоактивное мочение белков с последующей очисткой
Дот-фар-вестерн-анализ
Флуорометрический анализ
Биоинформатический анализ последовательности
Результаты исследования и их обсуждение
Подтверждение функциональной активности in vivo промоторов фага Т5, выявленных в искусственных системах, и идентификация новых промоторов фага57 Биоинформатический анализ последовательностей промоторов Т5, принадлежащих
к разным временным классам
Определение влияния мутаций в генах D5, D15 и С2 фага Т5 на транскрипцию генов
разных временных классов
Определение влияния мутаций в генах А1 и А2 фага Т5 на транскрипцию генов
разных временных классов
Выявление и идентификация белков, связанных с кор-ферментом РНКП в
инфицированных фагом Т5 клетках
Взаимодействие gp26 с кор-ферментом РНКП
Локализация мест взаимодействия gp26 с кор-фермеитом РНКП Е
Влияние gp26 на взаимодействие РНКП с промотором
Роль gp26 в регуляции транскрипции in vivo и развитии фага
Идентификация белков, кодируемых фКМУ-подобными бактериофагами,
связывающимися с РНК-полимеразами бактерий-хозяев
Проверка функциональной активности рр2-подобиых белков фКМУ-подобных фагов
in vivo
Функциональная активность gp2-nono6Hbix белков фКМУ-подобных фагов in vitro82
Выводы
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Тезисы конференций:
Публикации в журналах:
Список используемых источников

Обозначения и сокращения
а.о. - аминокислотный остаток
НК - нуклеиновые кислоты
нт - нуклеотидов
пн - пар нуклеотидов
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНКП - РНК-полимераза
тпн — тысяч пар нуклеотидов
фч — фаговые частицы
BSA - бычий сывороточный альбумин
DTT— дитиотреитол
dNTP — дсзоксирибонуклеозидтрифосфат
EDTA - этилендиаминтстраацстат
NTP - рибонуклсозидтрифосфат
SDS - додецилсульфат натрия
ТВЕ - трис-боратный буфер для электрофореза
ТАР - кислая пирофосфатаза табака
TMR - тетраметилродамин

вторичных структур, таких, как многократные прямые повторы в 18 нт., инвертированные повторы и 18 нт. палиндромы [113]. Возможно, ДНК-связывающие белки клетки-хозяина связываются с этими структурами, а закодированные в предранней области фагового генома белки участвуют в запуске SST, вытесняя белки хозяина, связанные в 1SS. Так как предраннип белок А1 может образовывать олигомеры с белком А2-3, который в свою очередь способен связываться с ДНК, предполагают, что именно эти белковые комплексы связываются с ДНК 1SS. Это предположение подтверждается как биохимическими исследованиями, в которых было показано, что SST может происходить только после синтеза белков А1 и А2-3, так н генетическими, показавшими, что амбер-мутанты по генам А1 и А2-3 неспособны к нормальному запуску SST [114].
Другая необычная особенность предранней стадии инфекции Т5 - экспорт оснований и нуклеотидов из клетки в первые минуты инфекции. ДНК клетки хозяина разлагается под действием предранних фаговых нуклеаз и продукта гена ihiip, 5’-дезоксприбонуклеотидазы, а образующиеся дезоксприбомононуклеозиды выводятся из клетки [115].
Бактериофаг Т5 содержит несколько самых сильных из охарактеризованных на сегодняшний день о70-промоторов, а экспрессия генов бактериофага зависит от транскрипционного аппарата клетки-хозяина, так как в геноме фага не закодированы ни собственная РНКП, ни а-факторы [116, 117]. ДНК FST содержит по крайней мере 2 промотора, с которых синтезируются предранние мРНК. Транскрипция предранних генов может происходить и с ников (данные не опубликованы). Большинство из 10 предранних белков не являются существенными для развития фага несмотря на то, что продукты именно этих генов оказывают самое губительное влияние на клетку хозяина: синтез хозяйских ДНК, РНК и белков быстро отключается; большая часть ДНК клетки хозяина деградирует. Такие ферменты хозяина, как EcoRl, RecBC, ДНК-метплазы, и урацил-ДНК-гликозилаза инактивируются. До сих пор не известно, какая нуклеаза ответственна за быстрое разрушение ДНК клетки хозяина. Функцию нуклеазы обычно приписывают белку А1 с молекулярной массой приблизительно 57 кДа. Считается что он ассоциирован с мембраной, т.к. по данным компьютерного анализа, N-концевая область содержит пептидный сигнал, который отвечает за связь мембраной [118]. А1 образует мультимеры и гетороолигомеры с 13,8 кДа белком А2-3 [119]. Белок А2-3 участвует в изменении структуры мембраны клетки н связывается с ДНК in vitro [120]. А1, А2-3, а также dmp - наиболее охарактеризованные предранние гены.