Роль протеасом и их субъединиц α-типа в гидролизе РНК и сплайсинге

• Автор: Федорова, Ольга Андреевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 119 с. : ил.

Содержание:
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цели и задачи исследования
1.3. Основные положения, выносимые на защиту
1.4. Научная новизна полученных результатов
1.5. Теоретическое и практическое значение работы
1.6. Публикации
1.7. Апробация работы
1.8. Финансовая поддержка работы
1.9. Структура и объем работы
1.10. Личный вклад автора
2. Обзор литературы
2.1. 26Б протеасома
2.1.2. 20Б протеасома
2.1.3. Регуляторные комплексы
2.1.3.1 .198 регуляторный комплекс
2.1.3.2. 11S регуляторный комплекс
2.1.3.3. Регулятор протеасом РА200 (BlmlO)
2.1.3.4. Ингибиторы 20S протеасом
2.2. Локализация протеасом в клетке
2.3. Ферментативные активности протеасом
2.3.1. Протеолитические активности протеасом
2.3.1.1. Убиквитин-зависимый протеолиз
2.3.1.2. Убиквитин-независимый протеолиз
2.3.2. Эндорибонуклеазная активность протеасом
2.4.. Участие протеасом в различных клеточных процессах
2.4.1. Участие протеасом в регуляции транскрипции
2.4.2. Участие протеасом в регуляции клеточного цикла
2.4.3. Участие протеасом в иммунном ответе

2.4.4. Репарация ДНК
2.4.5. Участие протеасом в апоптозе
2.4.6. Протеасомы и сплайсинг
2.5. Белки, ассоциированные с протеасомой
3. Материалы и методы
3.1. Культивирование клеток
3.2. Создание экспрессионных векторов
3.3. Экспрессия и очистка химерных белков
3.4. Транскрипция in vitro
3.5. Выделение препаратов цитоплазматических РНК
3.6. Обработка РНК с помощью химерных белков
3.7. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях
3.8. Электрофорез РНК в нативных условиях
3.9. Получение клеточного экстракта
3.10. Получение цитоплазматической и ядерной фракций белков
3.11. Метод GST-pulldown
3.12. Диск-электрофорез белков по Лэммли
3.13. Вестерн-блоттинг
3.14. Двухмерный электрофорез белков
3.15. Масс-спектром етрия
3.16. Сплайсинг in vitro
4. Результаты
4.1. РНКазная активность рекомбинантных субъединиц а-типа
протеасом человека
4. Анализ связывания клеточных белков с рекомбинантной
субъединицей а7 протеасомы человека
4.3. Анализ связывания белков, участвующих в сплайсинге, с рекомбинантной субъединицей а7 протеасомы человека
4.4. Участие протеасом в регуляции альтернативного сплайсинга

4.5. Участие протеолитических активностей протеасом в регуляции сплайсинга

5. Обсуяедение

6. Выводы
Список сокращений
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Литература

протеасом в контроле транскрипции показано на всех трех этапах (инициация, элонгация и терминация), при этом используются как протеолитические, так и неканонические активности.
Первое предположение об участии протеасом в транскрипции было показано еще в начале 1990-х годов (Swaffield et al., 1992), когда было обнаружено, что два белка, относящихся к 19S комплексу (Rpt4 и Rpt6), являются коактиваторами для дрожжевого транскрипционного фактора Gal4 (Rubin et al., 1996). Ранее считалось, что протеасомы локализуются только в цитоплазме. Однако впоследствии было показано, что как 26S протеасомы целиком, так и их субкомплексы присутствуют как в цитоплазме, так и в ядре различных клеточных линий (Peters et al., 1994). Анализ генома дрожжей показал, что компоненты протеасомы взаимодействуют с большинством генов и данная связь положительно коррелирует с траснкрипцией. При этом большая часть генов связывались либо с 20S, либо с 19S регуляторными комплексами (Sikder et al., 2006). Это дает основание предполагать, что 19S и 20S субкомплексы могут независимо друг от друга регулировать транскрипцию.
Для осуществления транскрипции в определенных генетических локусах необходимо ремоделирование хроматина в этих областях, что осуществляется с помощью различных модификаций гистонов и АТФ-зависимых перемещений гистонов, в составе нуклеосом, в промоторных областях гена. В связи с этим, экспериментальные данные указывают на то, что регуляторные 19S компоненты участвуют в процессе модификации гистонов (Collins, Tansey, 2006).
Роль АТФазных субъединиц Rpt6 и Rpt4 в ремоделировании хроматина впервые была показана у дрожжей (Muratani et al., 2003). Эти субъединицы необходимы для метилирования гистона НЗ по остаткам лизина в положении 4 и 79 (НЗК4 и НЗК79), которое происходит в участках активной транскрипции. Связывание субъединиц Rpt6 и Rpt4 с транскрибирующимися генами зависит от статуса убиквитинилирования