Система рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC: структура оперона и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз

• Автор: Тарасова, Маргарита Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИ
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
2.1. РАСПРОСТРАНЕНИЕ СИСТЕМ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ В ПРИРОДЕ
2.2. КЛАССИФИКАЦИЯ РМ СИСТЕМ
2.2.1. РМ системы 1 типа
2.2.2. РМ системы II типа
2.2.3. Сайт-специфические никазы
2.2.4. РМ системы III типа
2.2.5. РМ системы IV типа
2.3. РОЛЬ ФЕРМЕНТОВ РМ СИСТЕМ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ
2.4. ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ
2.4.1. Общая характеристика ДНК-метилтрансфераз
2.4.2. Особенности первичной структуры и классификация ДНК-метилтрансфераз
2.4.3. Вторичная и третичная структура ДНК-метилтрансфераз
2.4.4. Метилирование одноцепочечных и неканонических субстратов
2.4.6. Изменение специфичности ДНК-метилтрансфераз
2.4.6. Кинетические свойства ДНК-метилтрансфераз
2.5. ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ
2.5.1. Общая характеристика эндонуклеаз рестрикции
2.5.2. Строение эндонуклеаз рестрикции
2.5.3. Особенности эндонуклеаз рестрикции, узнающих палиндромные последовательности ДНК
2.5.4. Особенности эндонуклеаз рестрикции, узнающих непалиндромные последовательности ДНК
2.5.6. Механизм расщепления субстрата эндонуклеазами рестрикции
2.5.7. Особенности специфичности эндонуклеаз рестрикции
2.6. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОВ РМ СИСТЕМ
2.7. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РМ СИСТЕМ
2.7.1. Регуляция экспрессии генов РМ систем ДНК-метилтрансферазами
2.7.2. Регулягщя экспрессии генов РМ систем С-белками
2.7.3. Другие способы регуляции экспрессии генов РМ систем
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
З.Е МАТЕРИАЛЫ
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Приборы
3.2. МЕТОДЫ
3.2.1. Выращивание штамма-продуцента
3.2.2. Выделение эндонуклеазы рестрикции BspACI
3.2.3. Определения оптимальных условий работы R.BspACI
3.2.4. Определение специфичности эндонуклеазы рестрикции BspACI
3.2.5. Определение чувствительности R.BspACI к метилированию сайта узнавания
3.2.6. Клонирование генов ДНК-метилтрансфераз РМ системы BspACI
3.2.7. Клонирование и экспрессия гена bspACIMl
3.2.8. Выделение рекомбинантной Ml .BspACI
3.2.9. Определение концентрации белков
3.2.10. Определение оптимальных для работы ДНК-метилтрансфераз температуры, pH и концентрации солей NaCl и KCl
3.2.11. Определение метилируемого основания в сайте узнавания ДНК-метилтрансфераз BspACI
3.2.12. Определение стационарных кинетических параметров реакции метилирования ДНКметилтрансферазами BspACI
3.2.13. Клонирование и экспрессия гена bspACIM2
3.2.14. Выделение рекомбинантной М2.BspACI
3.2.15. Определение нуклеотидной последовательности оперона BspACI

3.2.16. Другие методы
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
.4.1. ОПИСАНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ BSPACI
4.2. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ BSPACI
4.2.1. Выделение эндонуклеазы рестрикции BspACI и определение оптимальных условий работы фермента
4.2.2. Определение специфичности эндонуклеазы рестрикции BspACI
4.2.3. Определение места гидролиза ДНК эндонуклеазой рестрикции BspACI
4.2.4. Исследование чувствительности эндонуклеазы рестрикции BspACI к т5С-метилированию сайта узнавания
4.3. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ РМ СИСТЕМЫ BSPAC1
4.4. АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ BSPACI
4.5. СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ M1.BSPACI
4.5.1. Получение рекомбинантной Ml .BspACI
4.5.2. Определение оптимальных условий работы Ml .BspACI
4.5.3. Определение основания, метилируемого Ml .BspACI
4.5.4. Определение наличия неканонического метилирования
4.5.5. Определение стагщонарных кинетических параметров реакции метилирования ДНК
4.6. СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ M2.BSPACI
4.6.1. Субклонирование гена bspACM2
4.6.2. Выделение М2. BspACI и определение оптимальных условий работы фермента
4.6.3. Определение основания, метилируемого М2.BspACI

хозяйской ДНК приведет к ее гидролизу. По-видимому, именно возникновение этих контактов активирует каталитические центры мономеров. Замена аминокислотного остатка, участвующего в специфическом узнавании основания только в одной субъединице, предотвращает расщепление обеих цепей [Pingoud and Jeltsch, 2001].
Исключение из общего правила узнавания и расщепления симметричных последовательностей ДНК составляет ЭР MspI, имеющая сайт узнавания 5’-CCGG-3’. Данный фермент функционирует в виде мономера, асимметрично узнавая обе цепи ДНК двумя различными структурными мотивами [Xu et al
2004].
2.5.4. Особенности эндонуклеаз рестрикции, узнающих непалиндромные последовательности ДНК
Работы по изучению ЭР, узнающих несимметричные последовательности ДНК, показали, что их механизм расщепления радикально отличается от такового у ЭР, гидролизующих ДНК по палиндромным сайтам узнавания. Многие эндонуклеазы подтипа IIS содержат разделенные ДНК-связывающий и ДНК-гидролизующий домены, как в случае ЭР FokI [Wah et al., 1998; Vanamee et al., 2001], Bfil [Grazulis et al.,. 2005] и Mnll [Kriukiene, 2006]. В отличие от большинства ферментов подтипа IIP, которые обладают каноническим PD-(D/E)XK каталитическим мотивом, каталитический сайт ЭР подтипа IIS может иметь помимо серии вариантов канонического каталитического мотива PD-(D/E)XK одну из трехмерных укладок, указанных выше (см. рис. 5). Chan с соавторами предложил следующую классификацию ЭР, узнающих несимметричные последовательности нуклеотидов, основываясь на их молекулярной структуре и механизме двухцепочечного расщепления [Chan et al., 2011].
Класс I.
К первому классу относятся ЭР, функционирующие в виде гомодимера, каждый мономер которого содержит по одному каталитическому сайту. Сюда относятся ферменты FokI, Mlyl, Alwl. FokI является первым обнаруженным