Регуляция экспрессии генов пороформирующих токсинов B. cereus

• Автор: Шадрин, Андрей Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
АТР - аденозин трифосфат
СТР - цитидинтрифосфат
GTP - гуанозинтрифосфат
UTP - уридин грифосфат
итф - нуклеотид трифосфаты,
пн - пары нуклеотидов
нт - нуклеотиды
РНКП - РНК полимераза
КсРНКП - РНК полимераза E. coli
Äs-РНКП - РНК полимераза В. subtilis
ТК - транскрипционные комплексы
ЗК - закрытый комплекс,
OK — открытый комплекс,
НТК - инициирующий транскрипцию комплекс,
ЭТК - элонгационный комплекс,
ОРС - открытая рамка считывания;
ПЦР - полимеразная цепная реакция CmR - резистентность к хлорамфениколу EmR - резистентность к эритромицину ЭДТА - Этлендиаминтетрауксусная кислота БСА - бычий сывороточный альбумин
ПДРФ - Полиморфизм Длины амплифицируемых фрагментов
MLST - Мультилокуспое секвенационное типирование
ИПТГ - Изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид
PMSF - Фенилметилсульфонилфторид
DTT - Дитиотриетол
э/ф - электрофорез
ГА - гемолитическая активность

ОГЛАВЛЕНИЕ:
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
ОГЛАВЛЕНИЕ:
ВВЕДЕНИЕ
1. Токсины Bacillus cereus их регуляторы
1.1. Микроорганизмы группы Л. cereus
1.2. Токсины бактерий группы В. cereus
1.2.1. Фосфолипазы
1.2.2. Энтеротоксины: гемолизин BL. негемолитический энтеротоксин, цитотоксин К и гемолизин II
1.2.3. Другие гемолизины В. cereus: гемолизин III, цереолизин О
1.2.4. Мало охарактеризованные токсины: энтеротоксин FM и энтеротоксин ВсеТ
1.3. Регуляторы хромосомных гемолитических факторов патогенности
1.3.1. PlcR, регулятор фосфолипазы С
1.3.2. HlylIR, регулятор гемолизина II
1.3.3. Fur, регулятор гомеостаза железа
1.3.4. Двухкомпонентная редокс чувствительная система ResD-ResE
1.3.5. Fnr, регулятор восстановления фумаратаи нитрата
1.3.6. FlhA регулирует секрецию НЫ и PC-PLC
2. Структура РИК-полимеразы прокариот и её транскрипционных комплексов
2.1. Структура кор-фермента РНКП
2.2. Структура холофермента
2.3. Инициация транскрипции. Особенности закрытого комплекса
2.4. Структура открытого комплекса [67]
2.5. Особенности структуры инициирующего транскрипцию комплекса. Абортивная инициация
2.6. Элонгационный комплекс [109]
2.7. Структура активного центра фермента
3. Особенности инициации транскрипции у микроорганизмов рода Bacillus
3.1. Структурные элементы промоторов
3.1.1. Базальные «-10» и «-35» элементы
3.1.2. «-10 удлиненный» элемент
3.1.3. UP-элемент
3.1.4. Дискриминатор
3.1.5. Заключение
3.2. Структурно-функциональные особенности РНКП микроорганизмов рода BacillusAQ
3.3. Транскрипционные факторы, регулирующие инициацию транскрипции [122]
3.3.1. Простая активация

3.3.2. Простая репрессия
3.3.3. LacI блокирует разделение цепей ДНК в районе +6/+7 на промоторе /ncUV5.
3.3.4. CRP стимулирует формирование «продуктивного» ОК на промоторе malT
3.3.5. Белок Arc изменяет лимитирующую стадию на промоторе Pant
3.3.6. Белок р4 репрессирует промотор А2с. удерживая РНКП на промоторе
3.3.7. «Проскальзывающий синтез» (slippage synthesis)
3.3.8. Белок Q облегчает стадию «покидания промотора» X Pr’
3.3.9. Влияние Транскрипционных факторов па укладку хромосомы
3.3.10. Заключение
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Выделение хромосомной ДНК из B.cereus и В. thuringiensis для анализа ПЦР
2. Группоспецифическое ПЦР-фингерпринтирование
3. Анализ консервативных и полиморфных участков последовательностей генов cytK и hlyll
4. Детектирование cytK, hlyll и hlylIR ме годом ПЦР
5. Анализ ПДРФ cytK и hlyll
6. Детектирование психротолерантных штаммов
7. Определения гемолитической активности в бактериальной культуре (планшетная модификация)
8. Конструирование плазмид и рекомбинантных штаммов
9. Выделение и экспрессия рекомбинантных белков с his-гэгом (PlcR, RpoA(wt), RpoA(A60), SigA, HlylIR). Лиганд PlcR - PapR
10. Выделение РНКП из В. snbtilis
11. Реакции транскрипции in vitro и футпринтинга
11.1. РНК - полимераза
11.2. Получение матриц ДНК для транскрипции in vitro, перманганатного и ДНКазного футпринтинга
11.3. Анализ полноразмерных продуктов реакции транскрипции in vitro
11.4. Реакции абортивной инициации in vitro
11.5. Кинетика ассоциации транскрипционных комплексов
11.6. Кинетика диссоциации транскрипционных комплексов
11.7. Футпринтинг ДНК-белковых комплексов с помощью ДНКазы
11.8. KavlnO.i футпринтинг транскрипционных комплексов in vitro
11.9. Исследование комплексов формируемых РНКП совместно с PlcR или HlylIR методами транскрипции in vitro, ДНКазного перманганатного футпринтинга
12. Метод «задержки в геле»
13. Рутинные, широко используемые, методы
14. Реактивы и ферменты
15. Плазмиды, бактериальные штаммы и синтетические олигонуклеотиды

<2 A 2-4 A 4-6 A >6 A
Рис 3. Подвижные части бактериальной РНКП. Величина сдвига С^атомов подвижных частей РНКП обозначена цветом в соответствии со шкалой вверху рисунка, (а) Показано смещение подвижных частей в холоферменте относительно их положения в кор-ферменте [69]. (Ь) Смещение подвижных частей индуцированное взаимодействием холофермента с нуклеиновым каркасом [70]. Матричная цепь ДНК обозначена красным; нематричная цепь - синим; РНК - желтым; пурпурным - ион М§2+ каталитического сайта.
V108 петл«
Рис. 4. Структурные особенности элонгационного комплекса, (a-d) Смещение подвижных элементов в ЭТК относительно молекулы холофермента РНКП, в процессе закрывания створок, (а) общий вид структурных элементов формирующих клешню в ЭТК(серый) и холоферменте (лазурный). (Ь) Увеличенный вид клешни вблизи РНК/ДНК гибрида; (с) окружение переднего дуплекса ДНК; (d) вытеснение нового транскрипта РНК. (е) Стэкинг взаимодействия, образующиеся между /3’-крышкой и основанием задней границей РНК/ДНК гибрида, (f) Первое, вытесненное из РНК/ДНК гетеродуплекса основание РНК пойманное в карман, образуемый петлей Switch 3. На рисунках (e-f) /3’-крышка выделена синим цветом, а петля Switch 3 - оранжевым [70].