Молекулярно-цитогенетические маркеры хромосом льна посевного (Linum usitatissimum L.)

• Автор: Рачинская, Ольга Анатольевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Генетический полиморфизм и способы его оценки

1Л. Генный (аллельный) полиморфизм

1.2. Картирование генов и повторяющихся последовательностей с использованием флуоресцентной гибридизации т зКи

1.3. Хромосомный полиморфизм

1.3.1. Структурные изменения хромосомного набора

1.3.2. Добавочные В-хромосомы

1.3.3. Полиморфизм рисунков дифференциального окрашивания хромосом
1.4. Геномный полиморфизм
2. Полиморфизм льна посевного
2.1. Происхождение и классификация
2.2. Генетическое разнообразие льна посевного
2.2.1. Полиморфизм по морфологическим признакам
2.2.2. Полиморфизм по биохимическим признакам
2.2.3. Полиморфизм по молекулярным маркерам
2.2.4. Полиморфизм по хромосомным маркерам
3. Особенности анализа мелкохромосомных объектов
3.1. Актуальность увеличения разрешающей способности цитогенетических методов
3.2. Использование подходов, приводящих к увеличению длины метафазных хромосом
3.3. Химические особенности строения ДНК-интеркаляторов
3.4. Особенности применения наиболее распространенных в
цитогенетике интеркаляторов
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы для исследования

2. Методы исследования
2.1. Проращивание семян
2.2. Предобработка корневой меристемы
2.3. Фиксация корневой меристемы
2.4. Приготовление хромосомных препаратов растений
2.5. Флуоресцентная гибридизация in situ с различными зондами
2.5.1. Предобработка хромосомных препаратов перед FISH
2.5.2. Флуоресцентная гибридизация in situ
2.5.2.1. Мечение зондов
2.5.2.1.1. Рибосомные гены
2.5.2.1.2. CesA гены
2.5.2.1.3. Теломерный повтор
2.5.2.2. Гибридизация in situ
2.5.2.2.1. Денатурация хромосомных препаратов
2.5.2.2.2. Денатурация зондов
2.5.2.3. Отмывка препаратов и детекция сайтов гибридизации
2.6. Окрашивание хромосом
2.7. Анализ хромосомных препаратов
2.8. Статистическая обработка результатов измерений линейных
параметров хромосом
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Усовершенствование методики приготовления хромосомных препаратов льна
1.1. Повышение разрешающей способности хромосомного анализа с помощью пиридо[1,2-а)бензимидазолов
1.2. Усовершенствование метода приготовления давленных хромосомных препаратов
1.3. Тестирование воспроизводимости результатов маркирования хромосом льна с помощью метода DAPI-бэндинга и FISH с зондами 5S и 26S рДНК
2. Полиморфизм генома льна посевного
2.1. Идентификация хромосом льна посевного по рисункам ИАРІ-
бэндинга и локализации сайтов рибосомных генов
2.2. Хромосомный полиморфизм льна посевного
2.2.1. Внутривидовой хромосомный полиморфизм
2.2.2. Внутрисортовой полиморфизм льна посевного
2.2.2.1. Внутрисортовой полиморфизм льна посевного по
морфологии спутничной хромосомы
2.2.2.2. Внутрисортовой полиморфизм льна посевного по
локализации генов рРНК на спутничной хромосоме
2.2.2.3. Внутрисортовой полиморфизм льна посевного по
локализации рибосомных генов на хромосомах 3, 8,
3. Разработка дополнительных молекулярно-цитогенетических маркеров
для хромосом льна
3.1. Локализация последовательности теломерного повтора
(ТТТАССС) на хромосомах льна
3.2. Локализация консервативного фрагмента генов
целлюлозосинтетазы СеяА на хромосомах льна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

4. Методы исследования
2.1. Проращивание семян
Перед проращиванием семян проводилось их замачивание в растворе перманганата калия в течение 15-20 минут. После чего, семена промывались водой и помещались в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу. Семена проращивали в течение нескольких дней при комнатной температуре в темноте. В ряде случаев, для синхронизации прорастания, чашки Петри с семенами сначала помещали в холодильник при +4°С на два-три дня, а затем их выдерживали при комнатной температуре до появления корешков длиной 1-1,5 см.
2.2. Предобработка корневой меристемы
Кончики пророщенных корешков длиной 0,5-1,5 см отрезали и помещали в водный раствор 5мкМ/л интеркалятора ДНК 9-аминоакридина (9-АМА) (Sigma-АЫпсЬ, США), тормозящего процесс конденсации хроматина, на 12-16 часов. Для накопления клеток в стадии метафазы корешки в этом растворе выдерживали в холодильнике при температуре 0°С.
Наряду с 9-АМА в работе были протестированы три вещества из группы пиридобензимидазолов:
7-(трифторметил)пиридо[1,2а]бензимидазол-9-амина (9-НН2-7-СГ3-РВ[) (Рис. 2. II);
7-(амино)пиридо[1,2а]бензимидазол (7-1гН2-РВ1) (Рис. 2. I);
7-(трифторметил)пиридо[1,2а]бензимидазол (7-СРЗ-РВ1) (Рис. 2. I).
Все пиридобензимидазолы были синтезированы на базе Ярославского Государственного Университета им. П.Г. Демидова, на Кафедре органической и биологической химии.
Корешки растений выдерживались в водных растворах (5мкМ/л) вышеуказанных РВ1 при 0°С в течение 12-16 часов как и в случае использования 9-АМА.