Изучение взаимодействия импортируемой в митохондрии дрожжевой лизинговой тРНК с предшественником митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы

• Автор: Смирнова, Екатерина Васильевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
1. Введение
2. Обзор литературы: неканонические функции аминоацил-тРНК-синтетаз
2.1. АРСазьг. общие сведения
2.2. Внеклеточные функции АРСаз
2.2.1. АРСазы как цитокины
2.2.2. АРСазы как регуляторы ангиогенеза
2.2.3. Участие АРСаз в сборке ретровирусных вирионов
2.2.4. АРСазы как аутоантитела
2.3. Цитоплазматические функции АРСаз
2.3.1. АРСазы как регуляторы апоптоза
2.3.2. АРСазы как регуляторы трансляции
2.3.3. Необычные реакции, катализируемые АРСазами
2.3.4. Участие АРСаз в репликации ДНК у бактерий
2.3.5. АРСазы как регуляторы транскрипции генов
2.4. Ядерные функции АРСаз
2.4.1. Участие АРСаз в синтезе рРНК
2.4.2. Участие АРСаз в формировании З’-конца молекулы мРНК
2.4.3. Участие АРСаз в экспорте тРНК в цитозоль
2.5. Митохондриальные функции АРСаз
2.5.1. Участие АРСаз в сплайсинге интронов группы I митохондриальных РНК
2.5.2. Участие АРСаз в импорте тРНК в митохондрии
3. Материалы и методы
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Растворы
3.1.3. Коммерческие наборы
3.1.4. Приборы, оборудование и расходные материалы
3.1.5. Программное обеспечение
3.1.6. Штаммы микроорганизмов
3.1.7. Питательные среды
3.1.8. Генно-инженерные конструкции
3.1.9. Олигонуклеотиды

3.2. Методы
3.2.1. Полимеразная цепная реакция
3.2.2. Рестрикция
3.2.3. Электрофорез в агарозном геле
3.2.4. Дефосфорилирование
3.2.5. Очистка продуктов реакции рестрикции, ПЦР или
реакции дефосфорилирования
3.2.6. Лигирование
3.2.7. Переосаждение НК
3.2.8. Трансфекция клеток S. cerevisiae
3.2.9. Измерение поглощения кислорода клетками S. cerevisiae
3.2.10. Определение фенотипов штаммов дрожжей S. cerevisiae
3.2.11. Транформация клеток E
3.2.12. Выделение общеклеточной ДНК из клеток S. cerevisiae
3.2.13. Выделение фракции плазмидной ДНК из клеток E
3.2.14. Измерение содержания белка в препарате методом Бредфорд
3.2.15. Выделение митохондрий из клеток S. cerevisiae
3.2.16. Выделение промитохондрий из клеток S. cerevisiae
3.2.17. Выделение фракции малых РНК из митохондрий
(или промитохондрий) клеток S. cerevisiae
3.2.18. Выделение тотальной РНК из клеток S. cerevisiae
3.2.19. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле
3.2.20. Нозерн-блот гибридизация
3.2.21. Вестерн-блот гибридизация
3.2.22. In vitro Т7-транскрипция
3.2.23. Аминоацилирование тРНК
3.2.24. Транспорт радиоактивно-меченных тРНК в изолированные
митохондрии дрожжей (импорт in vitro)
3.2.25. Метод задержки в геле
3.2.26. Выделение тРЛ1 в аминоанилированной форме из клеток S. cerevisiae
3.2.27 Проверка статуса аминоацшшрования тРНК
3.2.28. Гетерологичсская экспрессия белков в клетках E
3.2.29. Аффинная хроматография белков с применение носителя с
иммобилизованными ионами никеля (Ni-агарозы)
3.2.30. Измерение кругового дихроизма белков

4. Результаты и обсуждение
4.1. Поиск участков preMsklp, являющихся ответственными за импорт
тРЛ1 в митохондрии дрожжей
4.2. Мутагенез участков Н1-НЗ и Н5-Н6 и исследование влияния
мутаций на импорт тРЛ1
4.3. Исследование влияния участков dl и d2 на импорт тРЛ1 в митохондрии
4.4. Поиск участков preMsklp, определяющих специфичность
импорта тРЛ1 in vivo
4.5. Разработка методики экспрессии preMsklp
Выводы
Благодарности
Список цитируемой литературы
Приложение

отсутствие матуразы Ы4 нарушался сплайсинг, однако эти нарушения суирессировались некоторыми мутациями ЛейРС в так называемых «сайтах супрессии» (Herbert et al., 1988). Для других мутаций, затрагивающих участки ДНК, располагающиеся рядом с «сайтами супрессии» было показано, что они сильно снижают эффективность сплайсинга, опосредованного ЛейРС, но не влияют на способность фермента аминоацилировать тРНК (Li et al., 1996). Эффективность сплайсинга оценивается по соотношению количества зрелой мРНК или ее предшественника, определяемого методом ОТ-ПЦР. Все описанные мутации (как супрессирующие отсутствие матуразы Ы4, так и препятствующие сплайсингу) локализованы в участке ЛейРС, названном СР1 (англ. connective polypeptide 1, соединительный полипептид 1), который образует отдельный домен третичной структуры ЛейРС, а также ВалРС, ИлеРС (Cusack et al., 2000), (Nureki et al., 1998). Для всех этих АРСаз было показано участие домена СР1 в редактировании корректности аминоацилирования (Mursinna and Martinis, 2002), но только в случае ЛейРС домен СР1 оказывался необходимым для сплайсинга мРНК. При этом домен СР1 ИлеРС не комплементировал мутации в домене СР1 ЛейРС. Судя по всему, домен СР1 ЛейРС взаимодействует с нитронами таким же образом, как и с лейциновой тРНК (Rho et al., 2002).
Для митохондриальной ТирРС N. crassa показано, что она участвует в сплайсинге интрона большой митохондриальной рРНК, стабилизируя каталитически активную структуру РНК. ТирРС связывается сначала с одним доменом РНК (Р4-Р6), способствуя образованию его устойчивой спиральной структуры, а затем со вторым доменом (РЗ-Р9), состоящим из спиралей РЗ, Р7, Р8, Р9, стабилизируя их взаимное расположение для образования каталитически активного сайта сплайсинга (Myers et al., 2002).
С-концевой домен синтетазы взаимодействует с доменом Р4-Р6 интрона, который сходен по структуре с антикодоновой петлей тРНК, а N-концевой домен связывается с элементами вторичной структуры Р5 и Р9, образующими структуру, аналогичную аминоакцепторному стеблю тРНК. Таким образом, ТирРС взаимодействует с интронами так же, как и с тРНК (Chen et al., 2004). Действительно, анализ результатов точечного мутагенеза ТирРС показал, что участки белка, необходимые для сплайсинга, распределены по аминокислотной последовательности и перекрываются с участками белка, ответственными за связывание тРНК (Kittle et al., 1991). Исследования, посвященные изучению структуры интронов I группы, показали явное сходство структуры интронов и тРНК (Myers et al., 2002).
В составе ТирРС N. crassa и P. anserina (для ТирРС последней также показано участие в сплайсинге митохондриальных РНК) обнаружены домены, отсутствующие в ТирРС, не участвующих в сплайсинге (например, ТирРС E. coli, S. cerevisiae) (Akins and Lambowitz, 1987): дополнительная альфа-спираль на N-конце белка (обозначаемая НО) и не-