Протеазы как цитотоксические агенты и маркеры злокачественных опухолей лёгкого

• Автор: Шубин, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ВАКУОЛИЗАЦИЯ, ВЫЗВАННАЯ КСЕНОБИОТИКАМИ И ПАТОГЕНАМИ
2.1 Введение
2.2. Сопровождаемая вакуолизацией клеточная гибель
под действием ксенобиотиков
2.2.1. Метуоз
2.2.2. Параптоз
2.2.3. Клеточное старение, некроптоз и онкоз
2.3. Вакуолизация при бактериальных инфекциях
2.3.1. Токсины структурного семейства АВ(5)
2.3.1.1. Токсины Stx2 и SubAB
2.3.1.2. Токсин CARDS
2.3.2. Пороформирующие токсины
2.4. Вакуолизация при вирусных инфекциях
2.4.1. Вирус лейкемии мышей
2.4.2. Вирус гепатита В человека
2.4.3. Вирус гепатита С человека и другие флавивирусы
2.4.4. Вирус обезьян SV40
2.4.5. Вирус папилломы человека
2.5. Заключение
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Реактивы и материалы
3.2. Клеточные линии, бактериальные штаммы, плазмиды и праймеры
3.3. Общие методы
3.3.1. Культивирование микроорганизмов и эукариотических клеток
3.3.2. Манипуляции с ДНК
3.3.3. Микроскопия
3.4. Определение экспрессии генов пробелокконвертаз, матриксных мегаллопротеаз и катепсинов В и D на уровне мРНК в опухолевых тканях
лёгкого человека
3.5. Оценка цитотоксического действия генов исследуемых протеаз
3.5.1. Конструирование экспрессионных векторов

3.5.2. Получение моноклональных клеточных линий Tet-Off и Tet-Off Advanced
3.5.3. Оценка цитотоксического действия генов исследуемых протеаз
на клетки линии НЕК293 Tet-Off
3.5.4. Характеристика цитотоксического действия гена ЗСрго на клетки
линий А549 и Calu-1 Tet-Off Advanced
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Анализ экспрессии генов протеаз в тканях опухолей лёгкого человека
4.1.1. Экспрессия гена катепсина D снижена в опухолевых тканях лёгкого человека
4.1.2. Изменение экспрессии генов пробелокконвертаз при раке лёгкого
человека происходит по ограниченному числу сценариев
4.2. Характеристика цнтотоксическнх эффектов генов протеаз
4.2.1. Оценка цитотоксических эффектов при транзиентной экспрессии генов
протеаз в клетках линии НЕК293
4.2.2. Характеристика цитотоксического действия протеазы ЗС вируса
гепатита А человека
4.2.2.1. Экспрессия генов ЗСрго и ее каталитически неактивного варианта
в раковых клетках
4.2.2.2. ЗСрго индуцирует каспазонезависішую гибель клеток
4.2.2.3. Вызываемые ЗСрго вакуоли формируются из компонентов эндосомалъно-лизосомального компартмента
4.2.2.4. Вызываемая ЗСрго вакуолизация не зависит от функционирования
ГТФаз Rab5 и Rab7
4.2.2.5. Аутофагия не существенна для индуцированной ЗСрго вакуолизации
и клеточной гибели
4.2.2.6. Индуцированные ЗСрго вакуоли не обладают характеристиками деградирующих органелл и не связаны с гиперактивацией макропиноцитоза
4.2.2.7. Роль ЗСрго в развитии цитопатического эффекта вируса
гепатита А человека
4.2.2.8. Заключение
5. ВЫВОДЫ
6. БЛАГОДАРНОСТИ
7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
9. ПРИЛОЖЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность и степень разработанности темы исследования
Протеазы формируют одно из наиболее многочисленных и разнообразных семейств ферментов. В геноме человека около 1,7% всех генов кодируют протеазы, что превышает число генов киназ и уступает лишь количеству генов транскрипционных факторов [1]. Первоначально считалось, что роль протеаз в живых системах ограничивается процессами неселективной деградации белка. Однако по мере того как исследования охватывали все большее число протеаз, стало ясно, что их функции выходят далеко за рамки катаболизма белков. На сегодняшний день установлено, что протеазы функционируют в составе многочисленных сигнальных путей, осуществляя селективную активацию и инактивацию разнообразных субстратов (ферментов, структурных белков, ростовых факторов, рецепторов, гормонов, цитокинов и хемокинов) [2]. Таким образом, протеазы регулируют многие процессы как на уровне отдельных клеток (например, аутофагию, убиквитин-протеасомную деградацию белков, пролиферацию и программированную гибель клеток), так и в масштабах организма (сворачивание крови, развитие иммунного ответа, ангиогенез, реструктурирование и регенерацию тканей) [3].
Нарушение протеолитической регуляции является важным фактором развития многих патологических состояний, в том числе воспаления [4], нейродегенеративных процессов [5; 6], мышечных дистрофий [7], диабета [8; 9]. Существенную роль протеазы играют и в развитии онкологических заболеваний [10-12]. Для опухолевых клеток характерно повышение уровней экспрессии целого ряда протеаз (например, катепсинов, калликреинов, металлопротеаз и калпаинов), которые участвуют в деградации внеклеточного матрикса, процессинге митогенных факторов и запуске сигнальных каскадов, активирующих пролиферацию и миграцию раковых клеток [13; 14]. Некоторые типы опухолевых клеток демонстрируют снижение экспрессии или дисфункцию онкосупрессорных протеаз, в том числе каспаз, ответственных за развитие апоптотической гибели [15-18]. Таким образом, протеазы вносят вклад в агрессивность злокачественных опухолей и резистентность малигнизированных клеток к индукторам клеточной гибели.
В злокачественных опухолях происходит изменение экспрессии генов целого ряда протсолитических ферментов. При этом уровни экспрессии генов протеаз в опухоли часто коррелируют с ее агрессивностью и в связи с этим рассматриваются как факторы диагностики, подбора оптимальной терапевтической стратегии и прогноза сроков повторного развития

Таблица 3.2. Синтетические олигонуклеотиды.
Праймер Последовательность8 T„„A°C
Bi2Af ACCAAGCAGCTGACCACCATGGGATTCGGACACCAAAACAAA
Bi2Ar GTAATTGCTAGCTTATTGTTCCATGGCTTCTTCTTC
Bi3Cf GCAGAAGATATCGCC^CCATCTCAACTCTAGAAATAGCAGGA
Bi3Cr CACnTCCTAGCTTACTGACTTTCAATTTTCTTATC
Bi3Cm-f Bi3Cm-r GGTCTTCCCGGGATGGCTGGTGGGGCCCTAGTG CACTAGGGCCCCACCAGCCATCCCGGGAAGACC Bi3Cm-f/Bi3Cr - 58, Bi3Cm-r/Bi3Cf -
BiCathBf TTAATACAGCTG/fCCVfCCATGTGGCAGCTCTGGGCCTCC
BiCathBf-pro ATGTTTCAGCTG/I CCA CCATCCGGAGC AGGCCCTCTTTC
BiCathBr TAAATTGCTAGCCTAGATCTTTTCCCAGTACTG
BiCathDf TTTATTCAGCTGCC4CCATGCAGCCCTCCAGCCTTCTG
BiCathDf-pro ATGTTTC AGCTG// CCA CCATGCTCGTCAGGATCCCGCTG
BiCathDr TTAATTGCTAGCCTAGAGGCGGGCAGCCTCGGC
rt-GAPDHf rt-GAPDHr GTCAGTGGTGGACCTGACCT CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT
rt-3Cf rt-3Cr GGTTCAGTTTGGAGTTGGTGA TTCCTCTCCATGCCTGATCT
“Сайты рестрикции выделены жирным шрифтом, стартовые и стоп-кодоны подчеркнуты, последовательность Козак выделена курсивом. Праймеры были синтезированы в компаниях Синтол (Россия) или Евроген (Россия). г,Использованная в ПЦР температура отжига для пары праймеров.
агаризованной среде «L-агар» (1,5%-ный бакто-агар в среде LB), содержащих 100 мкг/мл ампициллина или канамицина.
Выращивание эукариотических клеток проводили в 24-х и 96-луночных планшетах, 25 см2 и 75 см2 культуральных флаконах (Corning, США) или РОС-ячейках (РеСоп, Германия) с использованием ростовой среды на основе DMEM/F12 (с добавлением 10% ЭТС и 0,3 мг/мл глутамина) при 37°С в атмосфере с 5% содержанием СОг. Выращивание культур моноклональных клеточных линий Tet-Off и Tet-Off Advanced проводили с добавлением в ростовую среду антибиотика G418 (0,4 мг/мл на стадии селекции и 0,2 мг/мл при пассировании линий). Замену ростовой среды на свежую проводили каждые 48 ч.
3.3.2. Манипуляции с ДНК
Электрофорез ДНК проводили в 0,8-2% горизонтальном агарозном геле при напряженности электрического поля 5-10 В/см, используя 89 мМ Tris-боратный буфер,