Характеристика внеклеточных протеасом при апоптозе клеток К562

• Автор: Зайкова, Юлия Яковлевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 117 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Основные положения, выносимые на защиту

1.4. Научная новизна

1.5. Теоретическое и практическое значение работы

1.6. Апробация работы

1.7. Личный вклад диссертанта

1.8. Финансовая поддержка

1.9. Объём и структура диссертации

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Протеасомы
2.1.1. Структура
2.1.3. Сборка20Б протеасомы
2.1.4. Регуляторные комплексы протеасом
2.1.5. Локализация протеасом
2.1.6. Убиквитин-протеасомная система деградации белка
2.1.6.1. Убиквитин-зависимый протеолиз
2.1.6.2. Убиквитин-независимый протеолиз
2.1.7. Участие протеасом во внутриклеточных процессах
2.1.8. Посттрансляционные модификации протеасом
2.1.9. Белки, ассоциированные с протеасомой
2.1.10. Протеасомы и апоптоз
2.1.10.1. Применение ингибиторов протеасом в раковой терапии
2.2. Внеклеточные протеасомы
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Культивирование клеток
3.2. Оценка индукции апоптоза в клетках К562
3.2.1. Проточная цитофлуориметрия
3.2.2. Флуоресцентная окраска хроматина
3.2.3. Анализ фрагментации клеточной ДНК
3.3. Выделение протеасом из клеток К562
3.3.1. Выделение протеасом из цитоплазмы клеток К562
3.3.2. Выделение протеасом из среды культивирования клеток К562
3.4. Флуориметрическое измерение протеолитической активности протеасом
3.5. Фракционирование протеасом на белковые субъединицы
3.5.1. Одномерный электрофорез
3.5.2. Двумерный электрофорез белков
3.5.2.1. Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ)
3.6. Иммунопреципитация
3.7. Вестернблотинг
3.7.1. Полусухой перенос белков с геля на мембрану
3.7.2. Связывание белков с антителами

3.8. іТЯА(2 масс-спектрометрия
3.9. Материалы
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Модель исследования
4.2. Подбор оптимальных условий для индукции апоптоза в клетках К562
4.3. Протеасомы в кондиционированной клетками среде
4.4 Выделение и очистка препаратов протеасом из клеток К562 и среды культивирования
4.5. Проблема присутствия сывороточных белков в препаратах внеклеточных протеасом
4.6. Изменение протеолитической активности протеасом
4.6.1. Изменение протеолитической активности протеасом при их выходе из клеток К562
4.6.2. Изменение протеолитической активности внеклеточных и внутриклеточных протеасом после индукции апоптоза доксорубицином
4.7. Изменение субъединичного состава вне- и внутриклеточных протеасом
4.8 Масс-спектрометрический анализ препаратов протеасом
4.9 Фосфорилирование субъединиц протеасом
4.10 Белки ассоциированные с протеасомами
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Внеклеточные протеасомы
5.2. Пептидазные активности внеклеточных протеасом
5.3. Посттрансляционные модификации субъединиц внеклеточных протеасом
5.4. Масс-спектрометричсский анализ препаратов протеасом
5.5. Фосфорилирование внеклеточных протеасом
5.6. Белки, ассоциированные с внеклеточными протеасомами
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

субъединиц: al, a4, a5, аб, a7, ß3 и ß4 (Schmidt et al2006). В 26S протеасомах клеток человека линии НЕК293 субъединицы а5, аб, ß4, Rpt3, Rpt5, Rpn2 оказались ацетилированными по первому метионину, а a4, a7, ß3, Rpt4, Rpt6, Rpn6 и Rpnl3/ADRM1 ацетилировались по второй аминокислоте после удаления стартового метионина (Wang et al., 2007).
В последнее время стало известно, что субъединицы протеасом могут быть ацетилированы по некоторым остаткам лизина. В клетках ос i рой мпелоиднон лейкемии человека линии MV4-11 ацетилированы субъединицы протеасом: al (Lys-102 и Lys-104), a2 (Lys-70 и Lys-171), a3 (Lys-127, Lys-176 и Lys-238), a7 (Lys-57, Lys-110, Lys-206, Lys-230 и Lys-238), ß3 (Lys-77), ß4 (Lys-68 и Lys-185), ß6 (Lys-204) (Choudhary et al., 2009).
В качестве ПТМ может выступать моноубиквитшшлирование (присоединение одной молекулы убиквитина к аминогруппе определённого остатка лизина). В экспериментах in vitro и in vivo было обнаружено моноубиквитинилирование многих белков, и стало известно, что присоединение одиночных молекул убиквитина может регулировать их функции и локализацию. Наиболее известными процессами, в которых важную роль играет моноубиквитинилирование белков, является регуляция гистонов, репарация ДНК, эндоцитоз и почкование ретровирусов от плазматической мембраны (Hicke, 2001).
Моноубиквитинилирование имеет большое значение для регуляции транскрипции за счёт модификации транскрипционных факторов. Активность большинства важных транскрипционных факторов: NF-кВ (Rape, Jentsch, 2004), рецепторов гормонов, онкосупрессоров р53 и Rb (Higashitsuji et al., 2005) и онкогена с-Мус (Sears, 2004) зависит от моноубиквитинилирования. Известно, что онкосупрессорный белок р53 имеет моноубиквитинилированную форму, за появление этой формы ответственен фермент Mdm2. Моноубиквитинилирование онкосупрессорного белка р53 с помощью Mdm2 способствует его экспорту из ядра (Li et al., 2003). Согласно исследованиям in vitro Mdm2 присоединяет одиночные молекулы убиквитина к 6 остаткам лизина в положениях 370, 372, 373, 381,