Флуоресцентные маркеры для молекулярной и клеточной биологии: флуоресцентные таймеры, постоянно флуоресцирующие и фотоактивируемые белки

• Автор: Верхуша, Владислав Витальевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 172 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список часто используемых сокращений
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Физико-химические свойства GFP-подобных белков
1.1.1. Источники флуоресцентных белков и хромопротеинов
1.1.2. Агрегация
1.1.3. Олигомеризация
1.1.4. Созревание: фолдинг белка и образование хромофора
1.1.5. Фотостабильность
1.1.6. pH устойчивость флуоресценции
1.2. Улучшенные мономерные красные флуоресцентные белки
1.2.1. Оранжевые и красные флуоресцентные белки
1.2.2. Дальне-красные флуоресцентные белки
1.2.3. Тетрамерный флуоресцентный таймер
1.3. Фотоактивируемые красные флуоресцентные белки
1.3.1. Необратимо фотоактивируемые ультрафиолетовым светом
1.3.2. Необратимо фотоактивируемые видимым светом
1.3.3. Обратимо переключаемые флуоресцентные белки
1.4. Структура флуоресцентных белков
1.4.1. Кристаллическая структура флуоресцентных белков
1.4.2. Структура и образование хромофора
1.4.3. Окружение хромофора
1.4.4. Образования ацилиминой связи в хромофоре
1.4.5. Планарность хромофора
1.5. Фотоконверсия в красных флуоресцентных белках
1.5.1. Необратимое фотопереключение
1.5.2. Цис-транс изомеризация хромофора
1.5.3. Фотоконверсии перманентных красных флуоресцентных белков
1.6. Перенос протона в возбужденном состоянии хромофора

1.6.1. Заряд хромофора и сеть водородных связей
1.6.2. Фотоцикл в GFP белке дикого типа
1.6.3. Зависимость переноса протона от окружения хромофора
1.7. Основные направления применения красных флуоресцентных
белков
1.7.1. Преимущества применения в клеточной биологии
1.7.2. Флуоресцентные белки как репортерные гены
1.7.3. Флуоресцентные белки как маркеры
1.7.4. Методы, основанные на FRET
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Методы молекулярной биологии
2.3. Выделение и характеризация рекомбинантных белков
2.4. Структурный анализ белков
2.5. Методы клеточной биологии
2.6. Флуоресцентная микроскопия клеток в культуре
2.7. Двухфотонная микроскопия и визуализация в мышах
2.8. Общая схема создания новых флуоресцентных белов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Мономерный синий флуоресцентный белок mTagBFP
3.1.1. Физико-химические характеристики очищенного mTagBFP
3.1.2. Использование mTagBFP в качестве донора FRET
3.1.3. Структуры хромофоров mTagBFP и его предшественника TagRFP
3.1.4. Трансформация тирозин содержащих хромофоров
3.2. Серия мономерных флуоресцентных белков-таймеров
3.2.1. Основные свойства очищенных рекомбинантных быстрого (FaslFT), среднего (MediumFT) и медленного (SlowFT) таймеров
3.2.2. Использование флуоресцентных таймеров для изучения внутриклеточных процессов
3.2.3. Структуры хромофоров FastFT и его синего мутанта В1ие102
3.3. Серия фотоактивируемых флуоресцентных белков PAmCherry

3.3.1. Свойства очищенных белков PAmCherry
3.3.2. Использование PAmCherryl в микроскопии сверхвысокого
разрешения PALM
3.3.3. Хромофор PAmCherryl в тёмном и флуоресцентном
состояниях
3.4. Фотоактивируемый красный флуоресцентный белок PATagRFP
3.4.1. Физико-химические характеристики PATagRFP
3.4.2. Использование PATagRFP в микроскопии траекторий единичных
частиц sptPALM
3.5. Обратимо фотопереключаемый красный флуоресцентный белок
rsTagRFP
3.5.1. Физико-химические свойства очищенного rsTagRFP
3.5.2. Свойства rsTagRFP в фотохромном FRET
3.5.3. Применение rsTagRFP в pcFRET в живых клетках
3.6. Мономерный дальне-красный флуоресцентный белок TagRFP657
3.6.1. Физико-химические характеристики очищенного TagRFP657
3.6.2. TagRFP657 в многоцветовых цитофлуорометрии и микроскопии
3.6.3. TagRFP657 в микроскопии сверхвысокого разрешения STED
3.6.4. Неинвазивная визуализация раковой опухоли с помощью
TagRFP657
3.7. Белки с большим стоксовым сдвигом LSSmKatel и LSSmKate2
3.7.1. Физико-химические характеристики LSSmKatel и LSSmKate2
3.7.2. Механизм большого стоксового сдвига в белках LSSmKate
3.7.3. Рациональный дизайн белков с большим стоксовым сдвигом
3.7.4. Использование белков LSSmKatel и LSSmKate2 для визуализации
процессов, происходящих в живых кле тках
3.7.5. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Отдельно следует отметить новый белок ТшГР, полученный на основе ЕозРР введением одной мутации Р1738, который сочетает в себе свойства как фотоактивируемого, так и фотопереключаемого белка. 1г1бРР необратимо фотоактивируется УФ-светом из зеленой в красную флуоресцентную форму, причем зеленая и красная флуоресцентные формы могут обратимо включаться и выключаться светом с длиной волны 440 и 561 нм соответственно [58]. Главным недостатком ГпвРР остается его теграмериое состояние.
Основываясь на структурных данных был проведен рациональный мутагенез зеленого флуоресцентного белка КлкО, который не обладает свойствами фотопереключаемого белка, и отбораны мутанты, способные к фотопереключеншо при облучении их УФ-светом. На первой стадии рационального мутагенеза была введена мутация 65Н для получения хромофора Н-У-О. После 30 циклов молекулярной эволюции был получен фотоактивируемый белок КакОГГ имеющий 8 мутаций в сравнении со своим предшественником Какв. При облучении КзкОК УФ-светом происходила фотоконверсия зеленой формы с максимумом флуоресценции при 517 нм в красную с максимумом флуоресценции 593 нм [59]. Дальнейшая оптимизация КлкОИ позволила получить его мономерную версию тЮкОИ, обладающую такими же физико-химическими свойствами [60]. Эффективность фотоактивации как КлкС11 так и тЮкСЯ сильно зависит от длины волны активирующего света (350-420 нм) и от pH среды, контраст их фотоактивации достигает 560. Данные белки могут быть активированы мягким излучением инфракрасного лазера. Красная форма ЮквЯ почти в 4 раза более фотостабильна красной формы белка ЕобЕР, хотя имеет сложную кинетику фотообесцвечивания.