Подавление экспрессии лейкозных онкогенов с помощью РНК-интерференции

• Автор: Спирин, Павел Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. ОСТРЫЙ МИЕЛОИДНЫЙ ЛЕЙКОЗ (ОМЛ)
1.2 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АНОМАЛИИ ПРИ ОМЛ
1.3 СВБ-ОМЛ
1.3.1 Г ен АМЫ (Я 1МХ1)
Белок АМЫ как активатор и репрессор транскрипции
Мутации гена АМЫ
1.3.2 Ген ЕГО
Прямые и непрямые взаимодействия белков ЕТО с НБАС
Взаимодействие белка ЕТО с репрессорами транскрипции Р1^Г и Ы
Ядерная локализация белка ЕТО
1.3.3 Мутантный белок АМЫ-ЕТО
Белок АМЫ-ЕТО как репрессор транскрипции
Белок АМЫ-ЕТО как активатор транскрипции
Потеря функций линиеспецифических факторов транскрипции опосредованная
АМЫ-ЕТО
Взаимодействия АМЫ-ЕТО с репрессорами транскрипции РГ^Б и
Функции белка АМЫ-ЕТО
1.4 МУТАЦИИ С-К1Т И РАЗВИТИЕ ОМЛ
1.4.1 Структура гена с-ки
1.4.2 Строение белка К1Т
1.4.3 Альтернативный сплайсинг с-ки
1.4.4 Ввзаимодействне КГГ-БСР и передача сигнала
Взаимодействие К1Т с БСБ
Сигнальные пути, запускаемые К1Т
1.4.5 Нарушения экспрессии с-ки при онкологических заболеваниях
Гиперэкспрессия К1Т
Аутокринная петля
Мутации, нарушающие функции К1Т
1.4.6 Роль с-ки в развитии ОМЛ
2. РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ
2.1 ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ РНК-ИНГЕРФЕРЕНЦИИ (РНЮ)
2.2 МЕХАНИЗМ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
2.3 ВИДЫ МАЛЫХ РНК, ПРИНИМАЮЩИХ УЧАСТИЕ В
ПОСТТРАНСКРИПЦИОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
2.3.1 я1РНК, образующиеся при вирусной инфекции
2.3.2 Эндогенные з1РНК

2.4 ТЕХНОЛОГИЯ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
2.4.1 Синтез siPHK in vitro
2.4.2 Экспрессия малых РНК внутри клетки
2.6. ПРИМЕНЕНИЕ ТЕХНОЛОГИИ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ В МЕДИЦИНЕ
2.6.1 Борьба с вирусными инфекциями
2.6.2 Терапия онкологических заболеваний
2.7 ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТЕХНОЛОГИИ РНК-
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
3. ЛЕНТИВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ
3.1 Структура генома и жизненный цикл лентнвирусов
3.2 Основные принципы конструирования лентивирусных векторов
3.3 Проблема образования репликационно-компетентных вирусных частиц
3.4 Инсерционный мутагенез
3.5 Проблема доставки генетической информации в клетки-мишени
3.6 Лентивирусы в генотерапии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
1. Клеточные линии
2. Плазмиды
3. Реактивы
4. Оборудование
Методы
Культивирование клеток
Пересев клеток
Определение скорости пролиферации клеток Kasumi-
Криоконсервация клеток
Получение дуплексов (сплавление) химически синтезированных олигорибонуклеотидов
Набор siPHK
Трансфекция siPHK-дуплексов
Получение ретровирусных векторных частиц, несущих экспрессирующую кассету:
промотор—целевой ген—IRES—маркёрный ген (cGFP)
Определение титра рекомбинантного ретровируса
Трансдукция прикреплённых клеток ретровирусными векторными частицами
Получение лентивирусных векторных частиц, направляющих синтез shPHK-AMLl-ETO,
shPHK-KIT-1, shPHK-KIT-2 и shPHK-SCR
Трансдукция прикреплённых клеток лентивирусными векторными частицами
Трансдукция клеток линии Kasumi-1 лентивирусными векторными частицами
Выделение тотальной РНК из клеточных культур тризолом
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция, сопряженная с полимеразной цепной реакцией
Проточная цитофлуориметрия
Анализ геномной ДНК методом Саузерна
Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Создание модельной линии клеток, геном которых содержит «лейкозный» активированный онкоген AMLl-ETO, RUNX1 или c-kit, с точечными мутациями
1.1 Внесение последовательностей экспрессирующих кассет:
промотор - целевой ген - IRES - маркерный ген (eGFP), в состав генома клеток-мишеней
1.2 Исследование уровня экспрессии “лейкозных” онкогенов, внесённых в составе экспрессирующей кассеты в геном клеток-мишеней, методом проточной цитофлуориметрии и ОТ-ПЦР
2. Дизайн и оценка эффективности действия синтетических модифицированных олигонуклеотидных siPHK (РНК-дуплексов), предназначенных для подавления активности «лейкозных» онкогенов
2.1 Дизайн последовательностей siPHK
2.2 Оценка эффективности подавления экспрессии активированных “лейкозных” онкогенов AML1-ETO и RUNXJ(K83N) с помощью синтетических siPHK в модельных клетках SC1-AML1-ETO и SC1-RUNX1(IC83N)
2.3 Оценка эффективности подавления экспрессии активированного “лейкозного” онкогена c-kit с помощью синтетических siPHK в модельных клетках SCl-c-kit(N822K)
3. Получение лентивирусных векторных частиц (рекомбинантных лентивирусов), несущих в своем геноме последовательность, кодирующую shPHK (предшественник siPHK) и оценка эффективности их действия на модельных линиях клеток
3.1 Получение лентивирусных векторных частиц, несущих в своём геноме последовательность, кодирующую shPHK предшественник siPHK
3.2 Оценка эффективности подавления экспрессии “лейкозных” онкогенов AML1-ETO и RUNX1(K83N) с помощью лентивирусных векторных частиц, направляющих синтез shPHK предшественников siPHK в модельных клетках-мишенях SC1-AML1-ETO и SC1-RUNX1(K83N)
3.3 Оценка эффективности подавления экспрессии “лейкозного” онкогена c-kit с помощью лентивирусных векторных частиц, направляющих синтез shPHK предшественников siPHK в модельных клетках-мишенях SCl-c-kit(N822K)
4. Оценка эффективности действия shPHK, направленных против AML1-ETO, на
линии клеток от пациента с острым миелоидным лейкозом
4.1 Оценка эффективности подавления экспрессии онкогена AML1-ETO в клетках линии Kasumi-1 методом РНК-интерференции
4.2 Оценка влияния подавления экспрессии онкогена АМЫ-ЕТО на рост клеток линии Kasumi-
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
Путь МК/БТАТ (8ТАТ1, БТАТЗ и 8ТАТ5) или каскады с участием представителей семейства Бгс (1уп), оказывающие влияние на пролиферативные свойства клеток, также могут запускаться с помощью К1Т (рис. 13) [82]. Методом иммунопреципитации было показано, что фосфорилированный по тирозиновым остаткам К1Т может взаимодействовать с Нзр90 [84].
Рис. 13. Сигнальные пути, запускаемые с участием KIT (пояснения в тексте) [83].
1.4.5 НАРУШЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ KIT ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
При онкологических заболеваниях часто наблюдаются нарушения экспрессии c-kit. Существуют опухоли, ассоциированные с активацией KIT в результате мутаций, приводящих либо к гиперэкспрессии тирозин киназы, либо к коэкспрессии рецептора и лиганда. Считается, что возникновение активирующих мутаций c-kit является одной из основных причин развития стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (GIST - gastrointestinal stromal tumor) [85]. Также известно, что при некоторых онкологических заболеваниях - раке