Действие белков YB-1 и РАВР на трансляцию полиа(-) и полиа(+)мРНК YB-1

• Автор: Елисеева, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура и функции Y-бокс-связывающего белка YB

1.1. Структура, доменная организация

1.2. Особенности взаимодействия YB-1 с другими молекулами

1.3. Функции YB-1 в ядре

1.4. Функции YB-1 в цитоплазме

1.5. Внеклеточные функции YB

1.6. Регуляция синтеза и активности YВ

1.7. Участие YB-1 в эмбриональном развитии и онкологических заболеваниях
2. Структура и функции поли(А)-связывающего белка РАВРС1
2.1. Структура, доменная организация и взаимодействие с другими молекулами
2.2. Функции
2.3. Регуляция синтеза и активности РАВР
3. Участие 3’НТО в трансляции
3.1. Регуляция с участием белков, взаимодействующих с 3’ НТО
3.2. Регуляция трансляции микрорегуляторными РНК, специфически связывающимися с 3 ’ НТО
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Плазмидные конструкции, использованные в работе
2. Методы работы с ДНК
2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.2. Трансформация Escherichia coli плазмидной ДНК
2.3. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli
2.4. Обработка плазмиды рестриктазой
2.5. Лигирование Т4 ДНК лигазой
2.6. Получение меченого фрагмента кДНК (ДНК-зонда) для Northen-блота
2.7. Электрофорез ДНК в геле агарозы
3. Методы работы с РНК
3.1. Синтез РНК in vitro
3.2. Дефосфорилирование РНК
3.3. Мечение РНК по 5’ концу Т4 полинуклеотид киназой
3.4. Получение РНК, биотинилированной по 3’ концу
3.5. Получение суммарной РНК из лизата ретикулоцитов кролика
3.6. Получение суммарной РНК из клеток HeLa
3.7. Получение суммарной кДНК
3.8. Получение поли(А)-фрагмента
3.9. Выделение РНК из полиакриламидного геля
3.10. Определение стабильности мРНК (Northem-блот)
3.11. Электрофорез РНК в полиакриламидном нативном геле
3.12. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле в присутствии мочевины
3.13. Электрофорез РНК в геле агарозы в денатурирующих условиях
4. Методы работы с белками
4.1. Выделение рекомбинантного РАВР
4.2. Выделение рекомбинантного YB
4.3. Выделение рекомбинантных GST и GST-Paip2
4.4. Обеднение ретикулоцитного лизата по РАВР
4.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
4.6. Иммуноблоттинг (Westem-блот)
5. РНК-белковые методы
5.1. Метод задержки в геле (гель-шифт)
5.2. Связывание на нитроцеллюлозных фильтрах
5.3. Ковалентные сшивки под действием ультрафиолета (УФ-сшивки)
5.4. Выделение белков на биотинилированную РНК
5.5. Бесклеточная система трансляции (БСТ) из ретикулоцитов кролика
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Исследование механизмов специфического действия YB-1 и РАВР на трансляцию А(-) мРНК YB
1.1. Регуляторный элемент необходим для специфической регуляции трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1 и РАВР
1.2. YB-1 ингибирует, а РАВР не влияет на трансляцию мРНК YB-1 с удаленным сайтом связывания РАВР
1.3. YB-1 и РАВР не влияют на трансляцию мРНК YB-1 с удаленным сайтом связывания YB
1.4. YB-1 ингибирует, а РАВР не влияет на трансляцию мРНК YB-1 с разделенными сайтами связывания РАВР и YB
2. Исследование механизмов специфического действия YB-1 и РАВР на
трансляцию полиаденилированной мРНК YB
2.1. Полиаденилирование мРНК YB-1 стимулирует ее трансляцию в лизате ретикулоцитов кролика
2.2. Полиаденилирование мРНК YB-1 не изменяет набора белков, сшивающихся с 3’ НТО мРНК YB-1 в лизате ретикулоцитов кролика
2.3. YB-1 ингибирует трансляцию А(+) так же как и А(-) мРНК YB
2.4. РАВР не стимулирует трансляцию полиаденилированной мРНК YB-1 в лизате ретикулоцитов кролика
2.5. В условиях недостатка РАВР трансляция как А(-), так и А50 мРНК YB-1 зависит от количества РАВР
2.6. Регуляторный элемент в 3’ НТО мРНК YB-1 взаимодействует с поли(А)-фрагментом в присутствии белков лизата ретикулоцитов кролика
2.7. Влияние РАВР на трансляцию полиаденилированной мРНК YB-1 зависит от длины участка РНК между регуляторным элементом и поли(А)-хвостом
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Роль YB-1 и РАВР в регуляции трансляции неполиаденилированной мРНК

2. Возможные механизмы действия YB-1 и РАВР на трансляцию
полиаденилированной мРНК YB
3. Регуляция трансляции мРНК YB-1 и ее место в общей регуляции белкового
синтеза
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
4ЕВР - eIF4E binding protein, белок
АР-домен - alanine/proline rich domain
ARE - AU-rich element
ARS - adenine-rich autoregulatory sequence
ATP - adenosine triphosphate
AUF1 - AU-rich element RNA-binding protein
COLa2(I) - collagen type I a2 chain
CRS - cytoplasmic retention site
CSD - cold-shock domain
CTD - С-terminal domain
DEAD-бокс - аминокислотный мотив, содержащий последовательность D-E-A-D
dNTPs - deoxynucleotide triphosphates
DTT - dithiothreitol
EGF - epidermal growth factor
eIF4E (eIF3, eIF4F и т.д.) - eukaryotic translation initiation factor 4E (3, 4F и т.д.) ERK - extracellular-signal-regulated kinase GAT A - G-A-T-A binding protein
GM-CSF - granulocyte macrophage colony-stimulating factor GSK - glycogen synthase kinase GTP - guanosine triphosphate
Hepes - 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazineethanesulfonic acid HIV - Human immunodeficiency virus
hnRNPK и др. - heterogeneous ribonucleoprotein particle protein К и др.
IFNy - interferon gamma
IgRE - IFN-gamma response element
IL2, ILlp - interleukin 2, ip
IRES - Internal ribosome entry site
.INK - c-Jun N-terminal kinases
МАРК - mitogen-activated protein kinase
MDR (MDR1) - multiple drug resistance
MEK - MAPK/ERK kinase
MLLE-домен - домен, содержащий аминокислотные мотивы M-L-L-E
MN - micrococcal nuclease
MSY2/4 - mouse Y box protein 2/4
mTOR - mammalian target of rapamycin
NLS - nuclear localization signal
NMD - nonsense-mediated decay
NSP3 - non-structural protein
NTP - nucleotide triphosphates
PABP - poly(A) binding protein
PAP - poly(A) polymerase
PBS - phosphate buffered saline
PCNA - proliferating cell nuclear antigen
PDGF - platelet-derived growth factor
PI3K - phosphoinositide 3-kinase
PKC — protein kinase С
PRTE — pyrimidine-rich translational element

Антионкогенное действие. Было обнаружено, что YB-1 препятствует онкотрансформации, вызванной активацией PI3K-Akt сигнального пути (Bader et al., 2003). Оказалось, что в нормальных условиях большое количество слабых матриц, среди которых мРНК белков, имеющих отношение к росту и делению клеток, находятся в составе YB-1-содержащих нетранслируемых мРНП. Фосфорилирование YB-1 киназой Akt по Seri 02 приводит к снижению его сродства к кэпу и кэп-прилежащей области мРНК. В результате ингибирующее действие YB-1 на кэп-зависимую трансляцию за счет вытеснения с кэп-структуры фактора инициации трансляции eIF4E снижается (Bader and Vogt, 2008; Evdokimova et al., 2006). При этом ранее репрессированные «слабые» мРНК, кодирующие пролиферативные факторы, переходят в транслируемое состояние, что ведет к неконтролируему делению клеток. При оверэкспресии YB-1 с плазмиды увеличивается содержание нефосфорилированной формы YB-1, которая ингибирует в первую очередь трансляцию «слабых» матриц. В свою очередь, ингибирование их трансляции подавляет неконтролируемое деление клеток, вызванное гиперактивацией PI3K-Akt-киназного пути.