Особенности структуры глюкантрансферазы BGL2P и способ ее закрепления в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Безсонов, Евгений Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 143 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
I. ВВЕДЕНИЕ
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: БЕЛКИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ЗАКРЕПЛЕНИЯ
Введение
1. Компоненты клеточной стенки дрожжей
2. Способы ковалентной модификации белков клеточной стенки
2.1. Н-гликозилирование
2.2.0-гликозилирование
2.3. ОР1-якорь
3. Классификация и характеристика белков клеточной стенки по способу экстракции
3.1. Ковалентно закрепленные белки: ОР1 и РШ
3.1.1. ОРТбелки клеточной стенки
3.1.2. АБЬ-белки клеточной стенки
3.2. БЕР-белки клеточной стенки
3.2.1. Глюкантрансфераза В£12р клеточной стенки дрожжей
4. Примеры белков, ремоделирующих клеточную стенку дрожжей
4.1. р-1,3-глюканозилтрансфераза Оаз1р
4.2. Экзо-р-1,3-глюканазы
4.3. Эндохитиназа
4.4. Предполагаемые глюкан/хитин кросс-связывающие ферменты
4.5. Глюканазы Бсм4р и Бсу10р
4.6. Глюкантрансфераза В§12р
5. Заключение
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Используемые в работе реактивы
2. Штаммы микроорганизмов и условия их выращивания
3. Состав сред, используемых для культивирования микроорганизмов
4. Трансформация клеток дрожжей
5. Выделение суммарной ДНК дрожжей
6. Электрофоретические методы
6.1 Электрофорез ДНК в агарозном геле
6.2 Электрофорез белков в денатурирующих условиях
7. Вестерн-блот анализ
8. Окраска белков при помощи Кумасси
9. Окраска белков при помощи нитрата серебра
10. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения
11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
12. Выделение клеточных стенок дрожжей
13. Частичная депротеинизация клеточных стенок
14. Экстракция белков клеточных стенок дрожжей
15. Выделение глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей
16. Спектроскопия кругового дихроизма 52
17. Приготовление тотальных препаратов внутриклеточных белков
18. Приготовление препарата Bgl2p для МАЬП1-ТОЕ масс-спектрометрического анализа
18.1. Трипсинолиз белка в ПАМ'
18.2. Фракционирование пептидов, полученных в результате обработки белка трипсином
19. МА1ЛЭ1-ТОЕ масс-спектрометрия
20. Микроскопические методы анализа

20.1 Конфокальная микроскопия препаратов, окрашенных антителами и дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия клеточных стенок
дрожжей
20.2 Электронная микроскопия фибрилл, сформированных с участием глюкантрансферазы Вд12р
21. Связывание флуоресцентного красителя ТЫоЛауш Т (ТИТ)
22. Собственная флуоресценция глюкантрансферазы Е12р
23. Тушение собственной флуоресценции В§12р
24. Прочие методы
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Сравнение Вц12р, закрепляющегося в клеточной стенке, и Bgl2p, секретируемого в среду культивирования дрожжей Ь. сегеу1з1ае
1.1. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей У.сегеушае а-типа спаривания
1.2. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Ву12р из среды культивирования дрожжей Хсегеушае а-типа спаривания с нарушенным геном 8БШ1/МС04
1.3. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Вр12р из клеточной стенки ' штамма .5, се/г ушде а-типа спаривания с нарушенным геном 881121/МС04, несущего на плазмиде ген 881121/МСВ4 дикого типа
1.4. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы В§12р из клеточных стенок дрожжей 8.сегеш'ше А-типа спаривания
1.5. Обобщение результатов масс-спектрометрического анализа В§12р. Поиск различий в Ы-гликозилировании В£12р из клеточной стенки и среды культивирования
2. Формирование ассоциатов Bgl2p фибриллярной морфологии в препарате из среды культивирования штамма 5. cerevisiae А270 с нарушенным геном 88И21/МС04
3. Характеристика роли дисульфидных связей для закрепления глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок
4. Получение мутантов А- и а-типов спаривания с нарушенным геном ВОЬ2 из дрожжей X сегеУ1з1ае дикого типа
5.Фенотипическое проявление делеции гена ВСЬ2 на дрожжах & сегсушае А- и а-типов спаривания
6. Изучение конформационных особенностей Bgl2p из клеточных стенок дрожжей X сегсум/де дикого типа
6.1. Температурно-зависимые конформационные переходы Bgl2p
6.2.Измерение констант тушения собственной флуоресценции триптофановых остатков Е12 хлоридом цезия, иодидом калия и акриламидом
6.2.1 .Константы тушения хлоридом цезия
б.2.2.Константы тушения иодидом калия
6.2.3 .Константы тушения акриламидом
6.2.4.Общая характеристика данных по константам тушения хлорида цезия, иодида калия и акриламида при разных температурах
6.3. Дополнительное подтверждение уменьшения эспонированности остатков триптофана 112р при повышении температуры
6.4. Влияние pH среды и ионов двухвалентных металлов на значение параметра А
6.5. Рассчет параматра а-меры завершенности перехода из одного состояния молекулы в другое состояние
7. Заключение
V. ВЫВОДЫ

Приложение 1 .Компьютерный расчет масс пептидов Е12р, возникающих в результате гидролиза трипсином. Массы пептидов располагаются в порядке нахождения пептидов
в последовательности белка
Приложение 2. Компьютерный расчет масс пептидов 112р, возникающих в результате гидролиза трипсином. Массы пептидов располагаются по величине в порядке убывания.

Приложение 3 Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата В§12р из клеточных стенок
дрожжей Хсегегшас а-типа спаривания
Приложение 4. Соответствие значений детектированных масс при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата 112р из клеточных стенок дрожжей Б.сегеуіхіае а-типа спаривания вычисленным значениям масс пептидов,
которые должны получиться в результате гидролиза Е12р трипсином
Приложение. 5. Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата 112р из среды культивирования штамма дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном
8Би21/МС04
Приложение 6. Соответствие значений детектированных масс при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Е12р из среды культивирования штамма дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном
881221/МС04 вычисленным значениям масс пептидов, которые должны получиться в
результате гидролиза В£12р трипсином
Приложение 7. Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата В£12р из клеточной стенки штамма дрожжей 5'.сегеу'таг а-типа спаривания с нарушенным геном 851221/МС04,
несущего на плазмиде ген 88и21/МСБ4 дикого типа
Приложение 8. Соответствие значений детектированных масс при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточной стенки штамма дрожжей Шсегешйге а-типа спаривания с нарушенным геном 851221/МСВ4,
несущего на плазмиде ген 851221/МСВ4 дикого типа, вычисленным значениям масс
пептидов, которые должны получиться в результате гидролиза В§12р трипсином
Приложение 9. Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при повторном масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата В§12р из
клеточных стенок дрожжей 5.сегетшае А-типа спаривания
Приложение 10. Соответствие значений детектированных масс при повторном масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточных стенок дрожжей 8.сегетае А-типа спаривания вычисленным значениям масс пептидов,
которые должны получиться в результате гидролиза Bgl2p трипсином
VI. ССЫЛКИ

«ветвящего» фермента, ответственного за трансформацию линейного р1,3-глюкана в разветвленный р1,3-р1,б-глюкан (Goldman et al., 1995). Бьшо показано, что Bgl2p катализирует следующую трансферазную реакцию:
Е + Gn —► Е : G„.2 + G2
Е : G„-2 + Gy —> Е + Gn+y-г
где Е - фермент, G„ - донор (n>5), Е : G„.2 - промежуточный комплекс фермента с Р1,3-глюкановой цепью, G2 - высвобождаемый дисахарид, Gy - акцепторная цепь глюкана (у>4), Gn+y-2 - продукт трансферазной реакции, в котором цепи Р1,3-глюкана соединены Р 1,6-связью (Hartland et al., 1991; Goldman et al., 1995).
Транспорт молекул Bgl2p происходит в эндосомо-независимых везикулах из транс-Гольджи в плазматическую мембрану (Curwin et al., 2009). Данные везикулы носят название В§12р-везикул, в них, помимо данного белка, транспортируются компоненты, необходимые для расширения плазматической мембраны и перестройки КС (Harsay and Bretscher, 1995). Данный путь отличается от другого эндосомо-независимого пути, который используется клеткой для транспортировки Hspl50p, Ctslp, Scw4p, ScwlOp, Exglp, Cis3p и Ygplp (Curwin et al., 2009), а также от эндосомо-зависимого пути “инвертазных везикул”, транспортирующих белки приплазмы, такие как инвертаза, кислая фосфатаза и, возможно, общая аминокислотная пермеаза (Roberg et al., 1997). Маркированный Bgl2p путь транспорта может быть специфически блокирован мутацией гена компонента экзоциста Ехо70р (Не et al., 2007) и ГТФазы Rho семейства Cdc42p (Adamo et al, 2001).
Bgl2p проявляет высокую афинность к р1,3-глюкану и, что достаточно удивительно, к хитину (Klebl and Tanner, 1989; Mr§a et al., 1993). Делеция гена BGL2 не приводит к возникновению выраженного фенотипа при стандартных лабораторных условиях роста, за исключением небольшого увеличения содержания в КС хитина и щелочерастворимого (Р1,3-связанного) глюкана (Mrsa et al., 1993; Лауринавичюте с соавт., 2000; Sestak et al., 2004; Калебина с соавт., 2006). Показано, что А/jg/2-мутан гые клетки проявляют немного увеличенную смертность в связи со сниженной осматической стабильностью при выращивании на жидкой питательной среде (Teparic et al., 2004). В то же время, в нашей лаборатории показано, что старые клетки мутанта Ab gl2 (хранившиеся три месяца при 20°С на твердой среде YPD с добавлением агара) способны давать начало новым колониям, причем их количество равно количеству колоний, формируемых молодыми клетками. В тех же условиях старые клетки дикого типа формируют на 70% меньше колоний, чем молодые клетки того же штамма (Калебина с соавт., 2006). Также в нашей лаборатории была изучена способность /fAg/2-мутантов расти при условиях, далеких от