Метил-ДНК связывающие белки с доменами "цинковые пальцы": молекулярно-генетическая характеристика и анализ биологических функций методами нокаута

• Автор: Прохорчук, Егор Борисович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 224 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Г СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

4. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

4Л Метилирование генома эукариот

4.2 Геномный импринтинг. Х-инактивация

4.3 Инактивация X хромосомы

4.4 Динамика изменения метилирования во время эмбриогенеза

4.5 ДНК-метилтрансферазы

4.6 Метилирование ДНК при опухолеобразовании

4.7 Гидроксиметилцитозин
4.8 Метил-ДНК-связываюгцие белки
4.9 Связь между метилированием ДНК и ПТМ гистонов
4.10 Характеристика белков BTB/BOZ-семейства
4.10.1 Особенности BTB/POZ домена
4.10.2 Особенности домена «цинковые пальцы»
5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
5.1 Получение мыши нокаутной по гену Каизо
5.2 Инактивация гена Каизо у лягушки Xenopus Laevis
5.3 Инактивация гена Каизо у рыбы Danio rerio
5.4 ChlP-seq анализ, как новый метод для полногеномного картирования сайтов
связывания транскрипционных факторов с ДНК
5.4.1 Особенности ChlP-seq анализа
5.4.2 Приготовление геномных библиотек для секвенирования
5.4.3 Обработка данных, полученных в результате декодирования на Genome Analyzer GA (“Illumina”, США)
6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
6.1 Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков,
содержащих BTB/POZ домен и домен “цинковые пальцы”

6.1.1 Обнаружение метил-ДНК зависимого связывания белковых комплексов с энхансерным элементом гена S100A4 в экспериментах in vitro
6.1.1.1 Определение гиперчувствительных к обработке ДНКазой] участков в первом и втором интронах гена S100A4 мыши
6.1.1.2 Структурный и функциональный анализ консервативного района в первом нитроне гена S100a4
6.1.1.3 Функциональный анализ Sa последовательности энхансера гена S100A4 в контексте нуклеотидной последовательности ДНК
6.1.1.4 Изучение ДНК-белковых взаимодействий с Sa последовательностью in vivo
6.1.1.5 Определение в системе in vitro точных координат ДГУ2. Исследование белковых факторов, связывающихся с Sa последовательностью
6.1.1.6 Обнаружение белкового фактора, связывающегося с метилированной последовательностью ДНК, расположенной с 3' конца ДГУ2
6.1.2 Г ей Каизо кодирует белок, который является метил-ДНК связывающей
субъединицей комплекса МК1
6.1.2.1 Клонирование нового специфичного к метилированию ДНК белка Каизо
6.1.2.2 Изучение ДНК связывающих свойств рекомбинантного белка Каизо
6.1.2.3 Белок Каизо является метил-зависимым ранскрипционным репрессором in vivo
6.1.2.4 Белок Каизо взаимодействует с областью Н19 DMR in vitro
6.1.2.5 Каизо дифференциально взаимодействует с разными участками Н19 DMR
6.1.2.6 Определение профиля связывания Каизо в Н19/1£12-локусе
6.1.2.7 Каизо взаимодействует с отцовским метилированным районом Н19 DMR
6.1.3 Семейство Каизо-гомологичных белков
6.1.3.1 Два белка ZBTB4 и ZBTB38, гомологичных Каизо, узнают метилированную ДНК in vitro
6.1.3.2 ZBTB4 и ZBTB38 связывают метилированную ДНК in vivo

аргинину; для гистона НЗ наиболее хорошо охарактеризованы модификации по лизинам К4, К9, К27, К36, К79 и аргининам 112 и Ш 7. Каждый из лизинов может быть моно-, ди- и триметилирован. Метилирование лизинов может быть связано как с активацией, так и с подавлением транскрипции, в зависимости от сайта и вида метилирования [90]. Метилирование остатков лизина в положениях К9 и К27 (создаёт возможность для связывания ассоциированных с хроматином белков, например, белка НР1) сопряжено с репрессией транскрипции, тогда как метилирование лизинов в положениях К4 и К36 - с активным статусом хроматина [91]. В живой клетке постоянно существует динамическое равновесие между процессами, в которые вовлечены гистон-ацетилтрансферазы и гистон-деацетилазы. При исследовании эпигенетических модификаций, происходящих с трансгенными конструктами, было выяснено, что два разных процесса деацетилирование гистонов НЗ и Н4 и метилирование гистона НЗ -происходят приблизительно в одном временном интервале (хотя процессы деацетилирования совершаются быстрее) [92].
Примером, когда одна модификация может вызвать другую является метилирование 27 лизина гистона НЗ. Метилированные К27-НЗ привлекают белки Поликомб группы. Комплекс поликомб белков привлекает ЕЗ лигазу, которая может убиквитинировать гистон Н2А по лизину 119. Фосфорилирование и убиквитинирование гистонов в настоящее время активно изучаются. На данный момент нельзя однозначно сказать, что они связаны именно с активацией/репрессией транскрипции - скорее, каждая конкретная модификация определённого аминокислотного остатка играет свою специфическую роль.
Одним из наиболее актуальных вопросов эпигенетики является вопрос о том, что является первичным: метилирование ДНК или модификации гистонов. Первые предположения были сделаны после описания метил-