Разработка флуоресцентной системы поиска блокаторов потенциал-чувствительных калиевых каналов семейства Kv1

• Автор: Кудряшова, Ксения Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

Оглавление:

Список использованных сокращений

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Особенности строения и функционирования ПЧКК

1.1.1. Молекулярная организация

1.1.2. Селективность действия

1.1.3. Гомо- и гетеромультимеризация

1.1.4. Вспомогательные субъединицы

1.1.5. Сборка канала и транспорт в цитоплазматическую мембрану

1.1.6. Особенности активации и инактивации

1.2. Семейство каналов Kvl
1.2.1 Характеристика представителей
1.2.2. Регуляция работы каналов на уровне организма
1.2.3. Участие в регуляции клеточного цикла
1.2.4. Участие в развитие опухолей
1.2.5. Участие в апоптозе
1.2.6. Митохондриальная локализация каналов и апоптоз
1.2.7. Ассоциированные заболевания
1.2.7.1. Аутоиммунные заболевания
1.2.7.2. Нейрофизиологические отклонения
1.2.7.3. Астма
1.2.7.4. Заболевания пародонта
1.2.8. Функции в метаболизме
1.3 Модуляторы каналов семейства Kvl
1.3.1. Пептидные лиганды ядов
1.3.1.1. Токсины морских улиток
1.3.1.2. Токсины ядов змей

1.3.1.3. Токсины пауков
1.3.1.4. Токсины актиний
1.3.1.5. Токсины скорпионов
1.3.2. Непептидные лиганды
1.3.2.1. Неселективные блокаторы калиевых каналов
1.3.2.2. Селективные блокаторы каналов семейства Kvl
1.4. Методы поиска и исследования новых блокаторов Kvl-каналов
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Реагенты
22. Клонирование и экспрессия гибридных белков KcsA-Kv1a(x=13,6)
2.3. Приготовление сферопластов из клеток E. coli BL21(DE3)
2.4. Методика проведения экспериментов по анализу взаимодействия лигандов каналов Kvl.x с гибридными белками KcsA-Kvl.x (х=1,3,6) в составе мембраны сферопластов
2.5. Получение флуоресцентных изображений
2.6. Анализ данных
2.7. Методика поиска лигандов каналов Kvl.x в ядах животных
2.7.1. Анализ ядов пауков и секрета жабы
2.7.2. Анализ ядов змей
2.7.3. Фракционирование и анализ яда скорпиона H. laoticus
2.7.4. Анализ ядов скорпионов В. arenicola и A. amorenxi. Фракционирование и анализ ядов скорпионов О. scrobiculosus и М. eupeus
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Разработка флуоресцентной методики измерения и анализа взаимодействия лигандов с гибридными белками KcsA-Kvl.x на поверхности мембраны сферопластов

3.1.1. Подбор условий детекции взаимодействия R-AgTx2 с гибридными белками KcsA-Kvl.x (х=1,3>6) на поверхности мембраны сферопластов методом J1CKM
3.1.2. Разработка методики измерения констант диссоциации комплексов лигандов с гибридными белками KcsA-Kvl.x
(х=1,3,6)
3.2. Разработка состава и оптимизация свойств компонентов клеточных систем. Разработка протоколов подготовки компонентов к измерениям
3.2.1. Оптимизация экспрессии гибридных белков KcsA-Kvl.x (х=1,3,6) в составе мембраны E. coli
3.2.2. Изучение влияния компонентов буфера на результаты измерений связывания лигандов с гибридными белками Kvl.x (х=1,3,6)
3.3. Характеристика специфичности взаимодействия клеточных систем с известными лигандами Kvl-каналов
3.4. Анализ структурных особенностей взаимодействия пептидов AgTx2, КТХ и OSK1 с гибридными белками KcsA-Kvl.x (х=1,3,6)
3.5. Поиск высокоаффинных пептидных лигандов Kvl-каналов в ядах животных при помощи разработанных клеточных систем
3.5.1. Анализ ядов пауков
3.5.2. Анализ ядов змей
3.5.3. Анализ яда скорпиона H. laoticus и его компонентов
3.5.4. Анализ яда скорпиона О. scrobiculosus и его компонентов
3.5.5. Анализ яда скорпиона М. eupeus и его компонентов
Заключение
Выводы
Благодраности
Список процитированной литературы

матрикс митохондрий. При апоптозе белок Вах, встраиваясь в наружнюю мембрану митохондрий в виде мономера, ингибирует Kvl.3 (Lysl28 взаимодействует с поровым отверстием канала). В результате ток калия останавливается, развивается гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны. Гиперполяризация, конкурируя с дыханием, запускает продукцию АФК, которые в свою очередь, путем окисления липидов, способствует высвобождению цитохрома с из межмембранного пространства в цитозоль; параллельно может осуществляться выход цитохрома с по классической схеме через поры, образованные путем олигомеризации Вах в наружной мембране. Активация транзиентных пор (permeability transition роге, РТР) может быть также спровоцирована окислением остатков цистеина АФК. Открытие РТР приводит к деполяризации мембраны до 0 мВ, разрыву наружной мембраны и окончательному высвобождению цитохрома с в цитозоль.
Инкубирование изолированных митохондрий, содержащих Kvl.3 с Вах или с блокаторами Kvl.3 (MgTx, ShK, Psora-4) вызывало такие типичные события апоптоза, как изменения мембранного потенциала, образования АФК, высвобождение цитохрома с [98]. В митохондриях, лишенных Kvl.3, подобных эффектов не наблюдалось. Белок Вах с мутацией в лизине (ВахК128Е), ключевой аминокислоте, которая, как предполагалось, ответственна за взаимодействие с поровой частью канала, не вызывал ингибирование Kvl.3 и сопутствующих про-апоптотических эффектов как в изолированных митохондриях, так и в интактных клетках, экспрессирующих мутантный белок [108]. Полученные результаты подтвердили, что белок Вах связывается с каналом Kvl.3 в митохондриях и запускает апоптоз.
Позднее было показано, что mhtoKv1.3 может запускать апоптоз и Вахнезависимым образом [81]. Интересно это с той точки зрения, что довольно
часто опухоли лишены белков Вах/Вак [109]. Существует серьезная проблема