Комплексный подход к исследованию структуры белков на основе электронной микроскопии

• Автор: Соколова, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 221 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ МАКРОМОЛЕКУЛ
1.1. Применение электронной микроскопии в биологии, основы структурной протеомики.

1.2. Подготовка образцов нанобиообъектов
1.2.1. Объектные сетки и пленки-подложки:
1.2.2. Негативное контрастирование - преимущества и недостатки:
1.2.3. Крио-микроскопия:
1.2.4. Формирование изображения в ПЭМ:
1.3. Получение электронно-микроскопических изображений. Разрешение и критерии его
оценки
1.3.1. Сходство и различие светового и электронного микроскопов:
1.3.2. Аберрации:
1.4. Принципы реконструкции макромолекул
1.4.1. Сбор изображений частиц:
1.4.2. Двухмерные проекции как основа для трехмерного изображения:
1.4.3. Преобразование Фурье и факторы, влияющие на реконструкцию:
1.4.4. Центрирование:
1.4.5. Трансляционное и ротационное выравнивание:
1.4.6. Классификация электронно-микроскопических изображений
1.5. Трехмерная реконструкция: основные принципы
1.5.1. Факторы реконструкции:
1.5.2. Метод случайного конического наклона (RCT):
1.5.3. Метод обратных проекций:
1.5.4. Сопоставление проекций:
1.5.5. Разрешение реконструкции:
1.6. Методы определения трехмерной структуры целых клеток и клеточных органелл
1.6.1. Стереопары:
1.6.2. Принципы электронной томографии:
1.7. Интерпретация трехмерной структуры
1.7.1. «Визуальный» фиттинг
1.7.2. Фиттинг известной кристаллической структуры:
1.7.3. Программы для автоматического фиттинга:
1.7.4. Построение молекулярных моделей белков на основе моделирования по гомологии:
1.7.5. Мечение антителами или иммуномечение:
1.7.6. Мутагенез:
1.7.7. Кластеризация и образование комплексов:
1.7.8. Мечение наночастицами золота:
1.8. Значение структурной информации для медицины
1.8.1. Роль потенциал-зависимых калиевых каналов в организме человека
1.8.2 Канал Kv2
1.8.3. Канал Kv10.2:
1.8.4. Роль АСБ в организме человека:
1.9. Заключение
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования

2.2. Реактивы и оборудование
2.2.1 Реактивы:
2.2.2 Стандартные растворы:
2.1.3 Среды:
2.1.4 Маркеры размера и молекулярной массы:
2.1.5 Оборудование:
2.3. Общие биохимические и молекулярно-биологические процедуры:
2.3.1. Приготовление 1D4 колонки:
2.3.2. Получение компетентной культуры клеток E.coli:
2.3.2. Электрофоретическое разделение белков и Western blot:
2.4. Клеточные работы
2.4.1. Эукариотические клетки:
2.4.2. Прокариотические клетки:
2.5. Дизайн генов
2.5.1. Потенциал-зависимые ионные каналы:
2.5.2. Актинсвязывающие белки:
2.5.3. Спидроины:
2.6. Экспрессия и очистка белков
2.6.1. Ионные каналы:
2.6.2. Актинсвязывающие белки:
2.6.3. Аджитоксин:
2.6.4. Спидроины:
2.7. Электрофизиология
2.8. Связывание меченого нейротоксина белками ионных каналов
2.9. Флуоресцентные тесты
2.10 Искусственное прядение паутины и формирование нитей
2.11.Сканирующая электронная микроскопия
2.12. Моделирование по гомологии
2.13. Моделирование взаимодействия I-BAR доменов с PIP
2.14. ПЭМ макромолекул
2.15. ПЭМ срезов, залитых в пластик
2.16. ACM нанофибрилл, образованных спидроинами
2.17. Анализ вторичной структуры нанофибрилл паутины
ГЛАВА 3. ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА И ДОМЕННОЕ СТРОЕНИЕ КАЛИЕВЫХ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ
3.1. Введение
3.2. Очистка белков Kv каналов
3.2.1. Kv1.1:
3.2.2. KV2.1AC и KV2.1ACTA:
3.2.3. KV10.2:
3.3. Электронная микроскопия и обработка изображений:
3.4. Строение и конформационные изменения канала Kv1.1 (Shaker)
3.4.1. Трехмерная структура канала Shaker
3.4.2. Интерпретация 3D структуры и локализация доменов канала Shaker
3.4.3. Конформационные перестройки С-концевого домена канала Kv1 (Shaker) при взаимодействии с |3-субъединицей:
3.5. Трехмерная структура канала Kv2.1 и докализация его С-концевых доменов

3.5.1. Трехмерные структуры мутантных каналов Ку2.1ДСТАи Kv2.1aC:
3.5.2. Интерпретация 3D структур и локализация цитоплазматических доменов канала Kv2.1:
3.5.3. Сравнение структурных данных о цитоплазматических доменах канала Kv2.1 с экспериментальными:
3.5.4. Локализация «окон» между цитоплазматической и мембранной частями канала Kv2.1:
3.5.5. Конформационные изменения мембранного домена канала Kv2.1:
3.6. Построение молекулярной модели полноразмерного канала Kv10
3.7. Кластеризация Kv каналов и роль цитоплазматических доменов в этом процессе
3.7.1. Кластеризация каналов Kv2
3.7.2. Кластеризация каналов Kv10
3.7.3. Механизм образования кластеров
3.8. Гипотеза изменения конформационного состояния калиевых каналов при активации

3.9. Заключение
ГЛАВА 4 КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В АКТИНСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКАХ ПРИ АКТИВАЦИИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ЛИГАНДАМИ
4.1. Введение
4.2.Трехмерная структура комплекса CAP/srv2
4.2.1. Очистка белка Srv2:
4.2.2. Электронная микроскопия и обработка изображений:
4.2.3. Трехмерная структура N-Srv2:
4.2.4. Функциональная характеристика гексамера N-Srv2:
4.2.5. Структура С-концевого домена Srv2:
4.2.6. Модель полноразмерного комплекса Srv2:
4.3. Трехмерная структура формина mDial и основы его автоингибирования
4.3.1. Очистка формина, электронная микроскопия и обработка изображений:
4.3.2. 3D структура формина mDial (55-1255), полученная с помощью метода RCT:
4.3.3. 3D структура формина mDial (55-1255), полученная с помощью метода обратных проекций:
4.3.4. Интерпретация 3D структуры формина:
4.3.5. Сравнение ПЭМ данных о расположении доменов формина с данными рентгеноструктурного анализа:
4.3.6. Гипотеза физиологического обновления формина в клетке:
4.4. Структура комплекса Агр2/3 и его взаимодействие с лигандами
4.4.1. Электронная микроскопия и обработка изображений:
4.4.2. Конформационные изменения Агр2/3 комплекса при взаимодействии с лигандами:
4.4.3. Роль субъединицы р35 в активации Агр2/3 комплекса:
4.4.4. Гипотеза конформационных изменений Агр2/3 комплекса при активации и инактивации:
4.5. Заключение
ГЛАВА 5. СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ МОДИФИКАЦИИ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ I-BAR БЕЛКАМИ
5.1. Введение
5.2. Модификация липидных мембран I-BAR доменами
5.3. Структура полноразмерного IRSp53
5.3.1. Очистка IRSp53:

Во-первых, изображения должны быть получены в максимально возможном количестве ориентаций. Этого можно добиться, используя специфику объекта (спиральная, икосаэдрическая симметрия), экспериментальный дизайн (поворот сетки на заданные углы) или при произвольном расположении наночастиц на подложке.
Во-вторых, необходимо определить ориентацию и центр для каждой частицы. Итеративное уточнение этих параметров обычно проводят путем перекрестного сравнения между различными изображениями, или сравнения с проекционными изображениями предварительной трехмерной модели.
В-третьих, изображения частиц необходимо сдвинуть в пространстве для того, чтобы привести все объекты к общему виду. Только после этого можно рассчитывать трехмерную реконструкцию. Образцы с разной геометрией требуют различных схем сбора данных и разных подходов к реконструкции.
1.4.3. Преобразование Фурье и факторы, влияющие на реконструкцию:
Структурная информация от объекта может быть получена только в результате упругого рассеяния электронов. Амплитуды и фазы рассеянного пучка электронов можно описать с использованием преобразования Фурье, которое позволяет представлять колебательные процессы в виде набора синусоидальных составляющих - волнообразных кривых.
В основе преобразования Фурье лежит следующая предпосылка - почти любую периодическую функцию можно представить суммой отдельных гармонических составляющих (синусоид и косинусоид с различными амплитудами А, периодами Т и частотами ш) (рис. 15).
Когда рассеянные пучки объединяются с нерассеянными в плоскости изображения, они формируют интерференционную картину, которая прямо зависит от вариаций плотности и соответственно, интенсивности сигнала в образце. Биологические молекулы удовлетворяют теории формирования изображения, которая используется для того, чтобы описать фазово-контрастные изображения рассеянных электронов. Контраст практически отсутствует, когда изображение находится в истинном фокусе.
Для того, чтобы получить фазово-контрастное изображение, объединяют данные сферических аберраций и дефокуса (дефокусировка на 1-3 мкм ниже истинного фокуса используется для повышения контраста изображения).