Взаимодействие кинезина CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек

• Автор: Гудимчук, Никита Борисович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ЕЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие сведения о клеточном делении
1.1.1. Фазы митоза и общий план строения митотического аппарата
1.1.2. Микротрубочки
1.1.3. Кинетохоры
1.1.4. Проблема сопряжения кинетохора с динамическими микротрубочками
1.1.5. Моторные белки
1.1.6. Микротрубочки как генераторы сил
1.1.7. Развитие сил и перемещение хромосом во время митоза
1.2. Кинетохорный мотор CENP-E
1.2.1. Локализация и клеточные функции
1.2.2. Исследования CENP-E in vitro
1.2.3. Открытые вопросы
1.3. Методики исследования индивидуальных молекул in vitro
1.3.1. Микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF)
1.3.2. Лазерные ловушки
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Очистка белков
2.1.1. Тубулин
2.1.2. Daml и фибриллярные подвески
2.1.3. Полноразмерный белок CENP-E и его фрагменты
2.2. Измерение сил, развиваемых микротрубочкой
2.2.1. Измерение сил при латеральном закреплении без Daml комплекса
2.2.2. Измерение сил при латеральном закреплении с помощью Daml кольца
2.2.3. Измерение сил при торцевом закреплении с помощью Daml кольца
2.3. TIRE микроскопия CENP-E на стабильных микротрубочках
2.3.1. Приготовление стабилизированных микротрубочек
2.3.2. Приготовление простых проточных камер
2.3.3. Иммобилизация стабилизированных микротрубочек на покровном стекле
2.3.4. Одноцветная TIRF микроскопия на стабильных микротрубочках
2.3.5. Анализ движения белков CENP-E вдоль стабильных микротрубочек
2.4. TIRE микроскопия CENP-E на динамических мнкротрубочках
2.4.1. Приготовление затравок для роста динамических микротрубочек

2.4.2. Приготовление герметичных проточных камер
2.4.3. Иммобилизация затравок микротрубочек на покровном стекле
2.4.4. Двуцветная TIRF микроскопия на динамических микротрубочках
2.4.5. Ингибирование моторной активности CENP-E
2.4.6. Эксперименты с фрагментами CENP-E на квантовых точках
2.4.7. Анализ движения белков CENP-E на динамических микротрубочках
2.5. Измерение аффинности белков CENP-E к полимерам тубулина
2.5.1. Приготовление имитаторов концов микротрубочек
2.5.2. Измерение связывания CENP-E с имитаторами концов микротрубочек
2.6. Измерение характеристик CENP-E с помощью лазерной ловушки
2.6.1 Лазерно-микроскопная установка
2.6.2. Приготовление микросфер, покрытых белками CENP-E
2.6.3. Наблюдение транспорта микросфер белками CENP-E
2.6.4. Проведение эксперимента в режиме постоянной силы (Force Clamp)
2.6.5. Вольт-нанометровая калибровка квадрантного фотодетектора
2.6.6. Калибровка жесткости оптической ловушки
2.7. Эксперимент с сегментными микротрубочками
2.7.1. Иммобилизация аксонем микротрубочек на покровном стекле
2.7.2. Приготовление сегментных микротрубочек
2.7.3. Проведение эксперимента с сегментными микротрубочками
2.7.4. Анализ положения микросфер на микротрубочках
2.8. Компьютерное моделирование
2.8.1. Алгоритм расчетов движения CENP-E по микротрубочке
2.8.2. Определение параметров модели и калибровка
2.8.3. Проведение расчетов
2.8.4. Визуализация расчетов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1.1. Механика сопряжения грузов с разборкой микротрубочек белковым комплексом Daml
3.1.1. Сопрягающие свойства Daml кольца при латеральном закреплении
3.1.2. Сопрягающие свойства Daml кольца при торцевом закреплении
3.2. Взаимодействие между белком CENP-E и стенкой микротрубочки
3.2.1. Характеристики свободно движущихся белков CENP-E
3.2.2. Характеристики белков CENP-E, транспортирующих микросферы
3.2.3. Влияние внешней силы на движение белков CENP-E
3.3. Следование за динамическими концами мнкротрубочек
3.4. Необходимые и достаточные условии следования за динамическими концами микротрубочек белком CENP-E
3.4.1. Аффинности FL CENP-E к динамическим концам микротрубочек
3.4.2. Взаимодействие N-концевого фрагмента CENP-E с динамическими концами микротрубочекбб
3.4.3. Характеризация С-концевого сайта связывания для микротрубочек
3.4.4. Взаимодействие С-концевого фрагмента CENP-E с динамическими микротрубочками.
3.4.5. Воссоздание активности FL CENP-E путем объединения N- и С-концевых фрагментов CENP-Е
3.5. Математическая модель CENP-E и динамической микротрубочки
3.5.1. Описание модели
3.5.3. Сопоставление экспериментальных наблюдений с предсказаниями модели
3.6. Сопряжение белком CENP-E движения искусственных грузов с разборкой микротрубочки
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

2.4.7. Анализ движения белков CENP-E на динамических микротрубочках
Двухканальные записи анализировались как описано в разделе 2.3.5. С помощью ImageJ строились кимограммы движения конструктов CENP-E. Из кимограмм извлекались динамические характеристики микротрубочек, CENP-E, а также характеристики, определяющие движение CENP-E на концах микротрубочек.
2.5. Измерение аффинности белков CENP-E к полимерам тубулина
2.5.1. Приготовление имитаторов концов микротрубочек
Для получения ГДФ-связанного полимера тубулина использовались микротрубочки, стабилизированные таксолом (см. раздел 2.3.1).
В качестве полимеров тубулина, имитирующих удлиняющиеся концы микротрубочек, использовались GMPCPP-содержащие микротрубочки (см. раздел 2.4.1)
Для получения полимеров тубулина, имитирующих укорачивающиеся концы микротрубочек, использовались спирали тубулина, полимеризованные в присутствие винбластина[126]. Для этого 1 мг/мл тубулина, меченного родамином (степень мечения 1:20), инкубировалась в MES буфере (100 мМ MES pH 6.4, 1 мМ MgCb, 1 мМ EGTA, 0.1 мМ EDTA и 1 мМ DTT) с 10 мкМ винбластина в течение 30 минут при температуре 37°С. После этого спирали тубулина центрифугировались на воздушной центрифуге (airfuge, Beckman) при 126,000g в течение 30 минут при комнатной температуре. Осажденные спирали ресуспендировались в буфере BRB80 с 10 мкМ винбластином и сразу же использовались для связывания с белками CENP-E (см. раздел 2.5.2).
2.5.2. Измерение связывания CENP-E с имитаторами концов микротрубочек
Белки FL или TR CENP-E были диализованы в буфер BRB80 с 1мМ DTT в течение 1 часа 4°С. Далее 6 нМ TR или FL CENP-E инкубировались в течение 15 минут при комнатной температуре в пробирках с различными концентрациями полимеров тубулина. Буфер на основе BRB80, в котором происходила инкубация, содержал 2 мМ Mg-АДФ, 4 мг/мл БСА, 2 мМ DTT и 10 мкМ таксола или винбластина.
Комплексы CENP-E и полимеров тубулина осаждались центрифугированием на воздушной центрифуге (airfuge, Beckman) при 81,000g в течение 3 мин в случае микротрубочек или 126,000g в течение 30 минут в случае винбластиновых спиралей тубулина. Надосадки, содержащие несвязавшийся белок CENP-E, собирались и анализировались с помощью флуоресцентного микроскопа.