Механизм формирования комплексов α-лактальбумина с олеиновой кислотой и молекулярные аспекты их цитотоксического действия

• Автор: Князева, Екатерина Леонидовна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 107 с. : ил.

Список сокращений

a-JIA - а-лактальбумин;
OK — олеиновая кислота;
HAMLET (BAMLET) — специфический комплекс человеческого (коровьего) а-лактальбумина с олеиновой кислотой, описанный в (Svensson et al., 2000);
MAL - мультимерная форма человеческого а-лактальбумина, выделенная из казеиновой фракции молока, как описано в (Hakansson et al., 1995);
LA-OA-17 и LA-OA-45 — комплексы человеческого а-лактальбумина с олеиновой кислотой, приготовленные при 17°С и 45°С, соответственно, как описано в главе Материалы и методы,
bLA-OA-45 — комплекс коровьего а-лактальбумина с олеиновой кислотой, приготовленный при pH 12, 45°С, как описано в главе Материалы и методы; LAMPA - коиформационное состояние а-лактальбумина в комплексе с поли-Lys (Arg);
ЖК - жирные кислоты;
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;
I1EPES - 14-2-гидроксиэтилпиперазин-]Ы’-2-этансульфоновая кислота;
Трис - трис(гидроксиметил)метиламин;
ДЭАЭ-Трисакрил - диэтиламиноэтил-трис(гидроксиметил)метил-метакриламид;
ДПФХ - дипальмитоилфосфатидилхолин;
DMEM - питательная среда Игла, модифицированная Дульбекко;
НЕр-2 - клетки эпидермоидной карциномы гортани человека;
КД - круговой дихроизм;
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;
ЯМР - ядерный магнитный резонанс;
УФ - ультрафиолетовый;
ККМ - критическая концентрация мицеллообразования;
/.так - длина волны, соответствующая максимуму спектра флуоресценции;

[в] - молярная эллиптичность;
іа— температура середины теплового перехода
Оглавление

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Белки, селективно индуцирующие гибель раковых клеток
а-Лактальбумин: физико-химические свойства
Структура а-лактальбумина
Связывание катионов металлов
Стабильность а-лактальбумина
Взаимодействие а-лактальбумина с белками, пептидами и
низкомолекулярными органическими веществами
Функции а-лактальбумина
Цитотоксическая активность а-лактальбумина
Состояние HAMLET
Предклинические и клинические испытания HAMLET
Механизм действия состояния HAMLET
Взаимодействие с мембранами
Взаимодействие с гистонами
Апоптоз
Альтернативные пути клеточной гибели, запускаемые HAMLET
Структурные и физико-химические свойства HAMLET
Жирные кислоты и их взаимодействие с белками
Взаимодействие а-лактальбумина с жирными кислотами
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Методы
Общие процедуры
Выбор величины pH и температурных условий
Биохимические методы
Приготовление состояния HAMLET
Приготовление комплексов LA-OA-17 и LA-OA-
Приготовление комплекса bLA-OА-
Очистка белка от ионов кальция
Гель-фильтрационная ВЭЖХ
Приготовление липосом
Выделение комплекса белка с липосомами
Физические методы исследования
Оценка ёмкости белка по отношению к олеиновой кислоте
Флуоресцентные измерения
Круговой дихроизм
Измерение сродства белка к кальцию
Измерение сродства белка к олеиновой кислоте

фосфолипазы, белки ионных каналов, АТФазы, G-белки и протеинкиназы, свободные ЖК модулируют их функциональную активность. Жирные кислоты способны регулировать циклы фосфоинозитида и сфингомиелина, передачу гормонального сигнала и транскрипцию генов (Kogteva & Bezuglov, 1998).
Как следствие амфифильной природы жирных кислот, физические свойства индивидуальных ЖК в водных растворах зависят от ионизационного состояния их карбоксильных групп, температуры и величины ионной силы раствора (Cistola et al., 1988). Фазы, которые способны образовывать молекулы жирных кислот, суммированы в Таблице 1. Водная фаза соответствует насыщенному раствору мономерных ЖК или их мыл (натриевых или калиевых солей жирных кислот).
Таблица 1. Физические состояния, формируемые жирными кислотами, содержащими >10 углеродных атомов, в избытке воды в зависимости от pH и температуры (Т). Тс - температура плавления ЖК. Чёрные и белые кружки соответствуют анионному и протонированному состоянию карбоксильных групп, соответственно. Прямые и изогнутые линии представляют собой упорядоченные и неупорядоченные углеводородные цепи, соответственно.
Г11 7 рН~7 pH 7-9 рН~9 рН>
т>тс 2 фазы : масляная, водная 3 фазы: масляная, ламеллярная, водная штп шш 2 фазы: ламеллярная, водная 3 фазы: мицеллярная, ламеллярная водная 1 ^ 2 фазы: мицеллярная, водная
т<тс 2 фазы: кристаллы ЖК, водная 3 фазы: кристаллы ЖК, кристаллы, содержащие 1:1 ЖК и мыл, водная шиш ТТТГГТП шши тттштт 2 фазы: кристаллы, содержащие 1:1 ЖК и мыл, водная 3 фазы: кристаллы, содержащие 1:1 ЖК и мыл, кристаллы мыл, водная шяг ж 2 фазы: кристаллы мыл, водная