Исследование изменения количества копий и формирования делеций митохондриальной ДНК в клетках тканей мышей после воздействия ионизирующей радиации

• Автор: Антипова, Валерия Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 99 с. : ил.

Список использованных сокращений и обозначений

8-О-дГ -8-оксо-дезоксигуанин;

adPEO и arPEO (autosomal dominant and recessive forms of progressive external ophthalmoplegia) - аугосомно-доминантная и рецессивная формы прогрессирующей внутренней офтальмоплегии;

Н (heavy strand) - тяжелая нить мтДНК;

IISP (heavy strand promoter) - промотор тяжелой нити;

L (light strand) - легкая нить мтДНК;

LHON (Leber's hereditary optic neuropathy) — наследственная мышечная оптическая невропатия Лебера;

LSP (light strand promoter) - промотор легкой нити;

MELAS (mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke syndrome) — митохондриальная знцефаломиопатня, молочный ацидоз и случаи, подобные припадку; MERRF (myoclonic Epilepsy with Ragged Red Fibers) — миоклональная эпилепсия с красными шероховатыми фибриллами;
MNGIE (mitochondrial neurogastrointestinal encephalopathy) Митохондриальная нейрогастроинтенстинальная энцефалопатия;
Он (origin of replication of the heavy strand) - начало репликации тяжелой нити мтДНК;
Оь (origin of replication of the light strand) - начало репликации легкой нити м гДНК;
АДФ — аденозиндифосфорная кислота;
АТФ — аденозинтрифосфорная кислота;
АТФ6 и АТФ8 - шестая и восьмая субъединицы митохондриальной АТФазы;
АФК - активные формы кислорода;
Д-нетля (displacement loop) -петля смещения;
ДНР -двунитевые разрывы;
дНТФ - смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов;
ИИ - ионизирующее излучение;
ИР - ионизирующая радиация; мтДНК - митохондриальная ДНК;
НАД - никотинамидадениндинуклеотид;
НДГ - НАДН-дегидрогеназа;
НД 1-НД 6 - субъединицы 1-6 комплекса НАДН-дегидрогеназы;
И.о., т.п.о. - пары оснований (в ДНК) и тысячи пар оснований
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ПЦР-ПФ - полимеразная цепная реакция протяженных фрагментов; РНКаза А - рибонуклеаза А;
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан;
УФ - ультрафиолет;
ЦО - цитохромоксидаза;
ЭДТА - этилендиаминотетрауксусная кислота ЭРН - эксцизионная репарация нуклеотидов:
ЭРО - эксцизионная репарация оснований; яДНК — ядерная ДНК.
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Особенности митохондриального генома
1Л. Структура митохондриальной ДНК
1.2. Восприимчивость мтДНК к повреждению
1.3. Материнская наследственность
1.4. Гетероплазмия
1.5. Митотическая сегрегация
1.6. Пороговый эффект доли мутантных копий мтДНК
Глава 2. Компенсаторная репликация'мтДНК
Глава 3. Факторы регуляции активации репликации мтДНК и биогенеза
митохондрий
Глава 4. Делеции мтДНК
4.1. Делеции мтДНК - возможная причина митохондриальных заболеваний
и старения организма
4.2. Общие особенности делеции мтДНК
4.3. Механизм формирования делеции мтДНК
4.4. Делеции как маркер поврежденности митохондриального генома
Глава 5. Некоторые методы, применяемые для анализа количества копий и выявления делеции мгДНК
5.1. Полимеразная цепная реакция
5.2. Полимеразная цепная реакция протяженных фрагментов
5.3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
5.4. Саузерн-блот
5.5. Локус-специфическая ПЦР
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Оборудование
Компьютерные программы
Маркеры
Наборы реагентов
Химические реактивы
Ферменты

подвергались хроническому радиационному воздействию, но прекратили работу на этом предприятии 10-26 лет назад. Полученные результаты показывают, что уровень гетероплазмии мтДНК у этих работников не отличается от такового у людей из контрольной группы. Возможно, разницу в уровне гетероплазмии мтДНК у представителей этих двух групп трудно выявить, поскольку обе они состояли из курящих доноров в возрасте 67-81 лет. Можно также предполагать, что копии мтДНК, несущие мутации, подверглись селективному удалению в процессе пролиферации и обновления стволовых клеток и периферической крови в течение 10-26 лет после ухода этих работников с предприятия.
В настоящее время нет сведений о сроках сохранения индуцированных мутаций мтДНК в клетках после воздействия на организм повреждающих агентов. Возможно, значительная часть мутантных копий мтДНК в клетках периферической крови (в течение определенного периода времени после повреждающего действия химических агентов или радиации) в процессе обновления крови подвергается элиминации. Очевидно, удаление поврежденных молекул мтДНК из митохондрий играет важную роль в предотвращении накопления мутантных молекул и сохранения целостности митохондриального генома. Необходимое количество копни мтДНК в митохондриях, после удаления поврежденных, обеспечивается путем репликации оетавшихся в этих органеллах неповрежденных или мало поврежденных молекул. Эта компенсаторная индукция репликации мтДНК была продемонстрирована на клетках после их обработки окислителями [Lee et al., 2000] и после облучения животных ИР [Malakhova et al., 2005]. О возможности удаления поврежденных молекул мтДНК из митохондрий свидетельствуют следующие данные. Так, было доказано, что пирмидиновые димеры не репарируются в ДНК митохондриий УФ-облученных клеток, поскольку в этих органеллах не функционирует система ЭРН [Clayton et al., 1974]. Вместе с тем, наблюдается снижение частоты УФ-повреждений в мтДНК клеток животных и человека в результате удаления поврежденных молекул и синтеза новых копий [Pascucci et al., 1997; Kalinowsky et al., 1992]. Эти данные свидетельствуют о том, что из митохондрий могут быть элиминированы поврежденные молекулы мтДНК [Yasuliira, Yasui, 2000]. Поскольку в организме происходит постоянная гибель клеток и автофагия митохондрий, внеклеточные фрагменты мтДНК или ее цельные молекулы обнаруживается в плазме крови человека и в других биологических жидкостях. Они представляет значительный интерес для использования в качестве маркеров различных патологий [Тамкович и др., 2008].
В литературе недостаточно представлены сведения о формировании перестроек мтДНК тканей животных, подвергшихся воздействию ИР. Данные по анализу мутаций и делеций мтДНК, возникающих у специалистов, подвергшихся облучению в радиационных авариях, у онкологических больных, в процессе радиотерапии или у населения загрязненных