Функциональное исследование ионных каналов, вовлеченных в афферентную нейропередачу во вкусовой почке

• Автор: Кабанова, Наталия Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 106 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

II. 1. ОРГАНИЗАЦИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ВКУСОВОГО ОРГАНА

II.2. МЕХАНИЗМЫ ТРАНСДУКЦИИ ВКУСОВОГО СИГНАЛА

11.2.1. Ионные каналы как рецепторы и проводника вкусовых стимулов

11.2.2. Вторичные мессенджеры хеморецепторного пути передачи

вкусового сигнала.

II.3. СИНАПТИЧЕСКАЯ ПЕРЕДАЧА ВКУСОВОГО СИГНАЛА

11.3.1. Потенциал-зависимые Са2+-каналы.

11.3.2. Ионотропные Р2Хпуринорецепторы: структура и свойства.

И.З.З. Высоко аффинная десенситизация —уникальное свойство Р2Хз рецепторов. 28 III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
111.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
111.1.1. Выделение изолированных вкусовых клеток. 33 III. 1.2. Регистрация ионных токов вкусовых клеток.
Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp).
III. 1.3. Метод микрофотометрии и измерение [Са2
III. 1.4. Культура клеток.
Ш.1.5. Трансфекция клеток.
III. 1.6. ОТ-ПЦР. Клонирование. Рестрикционный анализ.
111.1.6.1. Идентификация а!-субъединицы, кодирующей Са.-каналы
вкусовых клеток мыши.
III. 1.6.2. Создание рекомбинантных плазмид pIRES2-EGFP/P2X2 и p!RES2-EGFP/I:>2Xj. 38 ИІ.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III. 2.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ ВО
ВКУСОВЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ
111.2.1.1. Функциональная идентификация вкусовых клеток, обладающих потенциал-зависимыми Са2 v-токами.
111.2.1.2. Идентификация Сау-каналов вкусовых клеток. Эффекты блокаторов.
111.2.1.3. Анализ экспрессии во вкусовой ткани генов, кодирующих ai-субъединицы
Са2~-каналов L-muna.
111.2.1.4. Исследование свойств неселективных ионных каналов во вкусовых клетках типа II как возможного пути секреции АТФ.

ІІІ.2.2. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ В
ЭКСПРЕССИОННОЙ СИСТЕМЕ.
111.2.2.1. Электрофизиологическое исследование рекомбинантных ІЙ-каналов hERG-muna в экспрессионной системе.
111.2.2.2. Реконструкция рекомбинантных Р2Х пуринорецепторов в клеточной
линии СНО.
111.2.2.3. Свойства АТФ-зависимых whole-cell токов, регистрируемых от клеток СНО, трансфицированных рекомбинантными Р2Х пуринорецепторами.
111.2.2.4. Высокоаффинная десенситизация гомомерных Р2Хз пуринорецепторов.
111.2.2.5. Модуляция активности рекомбинантных Р2Хз пуринорецепторов пептидными токсинами из яда паука.
IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
V. ВЫВОДЫ
VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
VII. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ.
Вкусовая почка млекопитающих представляет собой ассоциат нескольких десятков веретенообразных клеток, принадлежащих к различным морфотипам (тип I, тин II, тип III) и выполняющих различные физиологические (функции (Lindemann, 1996). Основополагающей функцией хемосенсорных клеток в составе этого периферического вкусового органа является распознавание вкусовых веществ, трансдукция и кодирование информации об их концентрации и вкусовой модальности с целыо дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга. Ряд фактов свидетельствует о том, что во вкусовой почке функционирует несколько сигнальных систем, которые в разных тканях вовлечены в межклеточные коммуникации. В частности, идентифицированы рецепторы к таким классическим нейротрансмиттерам и нейромодуляторам, как глутамат, серотонин, ГАМК, АТР, норадреналин, холектокинии, нейропептид Y (Roper, 2006, 2007). Хотя потенциально все эти рецепторы и их агонисты могут быть вовлечены в коммуникации между клетками вкусовой почки, окончательно не установлено, какие физиологические процессы протекают при участии конкретной сигнальной системы, и почему периферическая вкусовая система нуждается в столь большом количестве разных сигнальных молекул.
До недавнего времени, серотонин (5-hydroxytryptophan, 5-НТ) рассматривался в качестве основного кандидата на роль афферентного нейротрансмиттера во вкусовой почке. В пользу такой точки зрения были получены множественные, хотя непрямые, свидетельства (Roper, 2006). В частности, было установлено, что 5-НТз рецептор локализован в окончаниях вкусового нерва, иннервирующего вкусовую почку (Kaya et al., 2004), и что вкусовые вещества стимулируют высвобождение серотонина из вкусовой почки (Huang et al., 2005). Однако, когда в попытке получить прямые доказательства изучались мыши с нокаутированным геном 5-НТз рецептора, было показано, что эта генетическая модификация практически не влияет на сенсорную функцию периферической вкусовой системы, которая оценивалась в поведенческих экспериментах и по электрической активности вкусового нерва (Finger et al., 2005). Эти результаты фактически «похоронили» серотонин как ключевой афферентный нейротрансмиттер, непосредственно используемый для кодирования вкусовой информации. Хотя по совокупности данных важность серотонинергической системы для функционирования периферической вкусовой системы сомнений не вызывает, ее роль в физиологии вкусовой почки окончательно неясна.

температуре. Гидролиз Fluo-4AM клеточными эстеразами преобразует последний во Fluo-4, который накапливается в цитоплазме, а Са2+-зависимая флуоресценция Fluo-4 позволяет оценивать концентрацию внутриклеточного Са2+. После этого в течение 1 часа вкусовые клетки инкубировались в среде без красителя для того, чтобы весь негидролизованный краситель вышел из клеток. Флуоресценцию Fluo-4 возбуждали при помощи осветителя на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах (Хохлов и соавт., 2007). Излучение возбуждения и эмиссии фильтровалось интерференционными фильтрами (“Chroma”, США) в полосе длин волн 480 ± 10 и 535 ± 20 нм соответственно. (Рис.8)
Дихроичное
зеркало
Рисунок 8. Схема регистрации флуоресценции клеток-сенсоров АТФ.
Последовательные флуоресцентные изображения клетки регистрировали каждые 0,5-2 с и анализировались при помощи программы 1п^т§'УогкВепс11 5.2 (“П^ТОЕС Вю8у81е1ш”, США).
Все эксперименты проводились в растворе следующего состава (в мМ): 135 ЫаС1, 5 КС1, 1 СаСЬ, 1 М^БО,», 1 ЫагНРСЬ, 1 ЫаН2Р04, 5 ЫаНСОз, 10 НЕРЕБ (натриевая соль), 5 Глюкоза, 5 №-пируват, рН-7.4 при температуре 25-27 °С. Часть экспериментов проводилась в растворе, содержащем 100 нМ СаСЬ в котором дополнительно присутствовало 0,1 мМ ЕОТА.