Ca2+-зависимые механизмы устойчивости нейронов гиппокампа к повреждающим факторам гипоксии

• Автор: Туровская, Мария Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 142 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Гипоксия. Виды гипоксии
1.2. Г ипоксия головного мозга
1.3. Патологические состояния, связанные с условиями гипоксии
1.3Л. Инфаркт мозга
1.3 Л .2. Роль нейротрансмиттерных аминокислот при инфаркте мозга
1.3.2. Взаимосвязь гипоксии и канцерогенеза
1.3.3. Роль гипоксии в развитии болезни Альцгеймера
1.4. Сенсоры кислорода в клетке. Модели восприятия кислорода
1.4.1. Эффекторные молекулы клеток, регулируемые кислородом
1.4.2. Физиологические реакции клеток на изменение уровня кислорода. Мембранная модель хемотрансдукции
1.5. Са2+-транспортирующие системы клетки. Кальциевый гомеостаз
1.5.1. Механизмы входа Са2+ в клетки
1.5.1.1. Истинные рецептор-управляемые каналы
1.5.1.2. Са2+- каналы, активируемые вторичными посредниками
1.5.1.3. С-белок-управляемые Са2+- каналы
1.5.1.4. Потенциал-управляемые кальциевые каналы
1.5.2. Внутриклеточные Са2+-зависимые каналы
1.5.2.1. 1Р3 рецепторы (ИДЯ). Структура и регуляция
1.5.2.2. Рианодиновые рецепторы (ЯуЯ). Структура и регуляция
1.6. Глутаматные рецепторы
1.6.1. НМПА-рецепторы (ЫМОАЯ)
1.6.1.1. Структура и функции ЫМ1)А-рецепторов
1.6.2. АМРА-рецепторы (АМР А Я)
1.6.2.1. Структура и функции АМРА-рецепторов
1.6.2.2. Сигнализация и регуляция АМРА-рецепторов
1.7. Действие гипоксии на клетки мозга. Повреждающие факторы гипоксии
1.7.1. Изменение кальциевого гомеостаза в условиях гипоксии приводит к повреждению клеток мозга
1.7.2. Механизмы нарушения ионного транспорта при гипоксии. Роль глутамата и кальция
1.7.3. Активные формы кислорода (АФК) как повреждающий фактор гипоксии
1.8. Механизмы устойчивости клеток мозга к повреждающим факторам гипоксии
1.8.1. Эффект гипоксического прекондиционирования влияет на активность глутаматных и ГАМК-рецепторов нейронов мозга
1.8.2. Роль III! в формировании устойчивости клеток мозга к условиям гипоксии
1.8.3. Защитное действие белков теплового шока (НЬР) в условиях гипоксии
и их вклад в формирование гипоксического прекондиционирования
1.8.4. Нейропротекторные эффекты противовоспалительных цитокинов.
Роль интерлейкина-10 (ИЛ-10)
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Получение культуры клеток гиппокампа
2.2. Измерения уровня цитозольного кальция методом флуоресцентной микроскопии
2.3. Система для создания кратковременных эпизодов гипоксии
2.4. Система аппликации и отмывки веществ
2.5. Определение жизнеспособности клеток
2.6. Иммуноцитохимический метод выявления ГАМКергических нейронов
2.7. Использованные реактивы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Действие кратковременных эпизодов гипоксии на клетки гиппокампа
3.2. Действие кратковременных эпизодов гипоксии на активность АМРА-рецепторов нейронов гиппокампа
3.3. Действие кратковременных эпизодов гипоксии на активность ЫМОА-рсцепторов нейронов гиппокампа
3.4. Исследование длительности сохранения эффекта прекондиционирования, вызываемого кратковременными эпизодами гипоксии
3.5. Исследование механизмов постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа
3.6. Действие кратковременных эпизодов гипоксии на ГАМКергические нейроны гиппокампа
3.7. Исследование жизнеспособности клеток гиппокампа в условиях повторяющихся эпизодов гипоксии
3.8. Действие интерлейкина-10 на постгипоксическую гипервозбудимость нейронов гиппокампа, индуцированную активацией МУГОА-рецепторов и кратковременными эпизодами гипоксии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Известно, что предшествующие глобальной гипоксии и ишемии кратковременные эпизоды гипоксии защищают нейроны от гибели. При этом концентрация Са2+ в цитозоле ([Са2+]0 при глобальной ишемии уменьшается после прекондиционирования кратковременными эпизодами гипоксии (Semenov et al., 2009). Однако, наряду с защитным эффектом, кратковременные эпизоды гипоксии часто вызывают симптомы постгипоксической гипервозбудимости (Godukhin et al., 2002; Turovskaya et al., 2011), которая, как известно, является фактором, приводящим к гибели клеток.
Увеличение [Ca2+]i при действии глутамата может вызывать широкий спектр реакций нейронов, от нормальной синаптической нейропластичности и регуляции возбудимости нервных клеток до формирования нейротоксических эффектов, приводящих к апоптозу. Продолжительный вход кальция в цитозоль через активированные глутаматом рецепторы-каналы и потенциал-управляемые кальциевые каналы представляет собой ключевой фактор гибели нейронов при гипоксии и ишемии {Choi, 1985; Noh et al., 2005; Friedman, 2006). С другой стороны, амплитуда сигнала и частота Са2+-импульсов определяет специфику экспрессии генов, приводящей либо к развитию синаптической нейропластичности и повышению жизнеспособности, либо к повреждению и гибели нейронов {Perkinton et al., 1999; Vanhoutte and Bading, 2003; Zemke et al., 2004; Friedman, 2006; Obrenovitch, 2008).
Известно, что заболевания мозга сопровождаются индукцией внутримозговых иммунных и воспалительных процессов, основными медиаторами которых являются цитокины. Согласно современным представлениям, цитокины, обладающие мультифункциональным действием, играют важную роль в межклеточных взаимодействиях и продуцируются такими резидентными клетками мозга, как астроциты и микроглия. При повреждениях мозга, вызванных механической травмой, гипоксией/ишемией или инфекционными агентами, т.е., событиями, часто ведущими к последующему развитию таких заболеваний как эпилепсия, нейродегенерация и нарушение когнитивных процессов, экспрессия цитокинов в мозге резко возрастает. При этом экспрессируются не только провоспалительные цитокины, играющие отрицательную роль, но и противовоспалительные, способные оказывать нейропротекторные воздействия. Поэтому исследование механизмов защитного влияния на мозг цитокинов, обладающих одновременно иммуномодулирующими, антивоспалительными и трофическими эффектами, имеет важное значение для создания нового класса лекарственных препаратов, которые, в отличие от ныне существующих средств, будут обладать более широким спектром лечебного действия.
Из других внутриклеточных Са2+-каналов известны никотинамидаденин-динуклеотидфосфатный рецептор (НАДФ) и сфинголипидный рецептор (EDG1). НАДФ-рецепторы служат сигнальным триггером, блокируются высокими концентрациями НАДФ, а низкими - активируются, при этом высвобождается Са2+ из тапсигаргин-нечувствительных запасов. Сигналом для них является циклическая АДФ-рибоза. Сфинголипидный рецептор чувствителен к продуктам сфинголипидного пути преобразования липидов, вторичным посредником является, вероятно, сфингозин-1-фосфат или сфингозилфосфорилхолин-5 (Мельников, 2006).
1.5.2.2. Рианодиновые рецепторы (RyR). Структура и регуляция.
RyR рецепторы - Са2+-управляемые Са2+ каналы, специфически связывающие растительный алкалоид рианодин - впервые выделены из скелетных и сердечных мышц. RyR рецептор является гомотетрамером, состоящими из мономеров с молекулярным весом 550 КД и имеет довольно значительную гомологию с IP3 рецептором и небольшую - с потенциал-зависимыми Са2+ каналами (Shoshan-Barmatz and Ashley, 1998). На данный момент у млекопитающих идентифицировано три изоформы RyR рецептора RyRl, RyR2 и RyR3, которые кодируются тремя различными генами. Эти рецепторы довольно широко распространены в различных типах клеток, но наибольшая их часть сосредоточена в мышцах (Airey et al., 1993; Fill and Copello, 2002; Michael and Copello, 2002).
Скелетные мышцы обладают механизмом мобилизации Са2+, вызываемым деполяризацией дигидропиридин-чувствительных Са2+-каналов плазматической мембраны, которые служат потенциал-чувствительными передатчиками активирующего сигнала непосредственно Са2+-каналам сарколеммы (RyRl-тип) через связывающие белки и прямо активируют освобождение Са2+ из CP (Proenza et al., 2002; Protasi, 2002). В сердечных мышцах RyRl типа непосредственно связаны с высокопороговыми Са2+ каналами плазматической мембраны (L-тип) через кальцийсвязывающие белки и образуют единую функционально активную структуру. Для RyR2 рецепторов ЭР кардиомиоцитов, не связаных с плазмалеммой, требуется увеличение концентрации цитозольного Са2+ для стимуляции освобождения Са2+ из депо. Кроме этих двух типов Са2+-активируемых Са2+ каналов, недавно был идентифицирован третий тип Са2~ каналов ЭР (RyR3-ran), который является продуктом другого гена. Как было показано, этот третий тип Са2+ каналов ЭР не чувствителен к кофеину (Fill and Copello, 2002). RyRs имеют несколько мест регуляции, которая осуществляется Са2+ (колоколообразная зависимость) (Jeyakumar et al., 1998), ATP (Copello et