Повышение противоопухолевой активности цитокина TRAIL путем изменения аминокислотного состава белка

• Автор: Яголович, Анна Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 162 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список используемых сокращений
1. ВВЕДЕНИЕ, ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Апоптоз и терапия рака
2.2. Семейства белков TNF и TNFR
2.3. Apo2L/TRAIL- цитокин из семейства TNF
2.4. Структура TRAIL
2.5. Механизм TRAIL-индуцированного апоптоза
2.6. Рецепторы TRAIL
2.6.1. Рецепторы смерти DR4 и DR
2.6.2. Рецепторы-«ловушки» DcRl, DcR2 и OPG
2.6.3. Рецептор-специфичные мутантные варианты TRAIL
2.7. Физиологические функции TRAIL и его рецепторов
2.7.1. Формирование и регуляция иммунной системы
2.7.2. Иммунный контроль организма над первичным развитием опухоли и метастазированием
2.7.3. TRAIL и антивирусный ответ
2.7.4. Действие TRAIL на Т-клетки
2.7.5. Регуляция аутоиммунных процессов
2.7.6. Роль TRAIL в аллергических заболеваниях
2.7.7. Физиологическая роль TRAIL-R
2.7.8. Не-цитотоксические сигнальные пути TRAIL
2.8. Чувствительность клеток к TRAIL
2.8.1. Резистентность на уровне рецепторов TRAIL
2.8.2. Сборка комплекса DISC и резистентность к TRAIL
2.8.3. Повышенная экспрессия cFLIP

2.8.4. Инактивация каспазы-
2.8.5. Изменения в митохондриальном пути апоптоза
2.8.6. Белки-ингибиторы апоптоза LAPs, Smac/DIABLO и резистентность к TRAIL
2.8.7. NF-кВ и резистентность к TRAIL
2.8.8. МАР-киназы и резистентность к TRAIL
2.8.9. Комбинация TRAIL и химиотерапии для преодоления
резистентности
2.9. TRAIL и токсичность
2.9.1. Рекомбинантные варианты и токсичность
2.9.2. Токсичность на гепатоцитах
2.10. Доклинические и клинические испытания TRAIL
2.10.1. Доклинические исследования TRAIL
2.10.2. Клинические исследования TRAIL
2.11. Экспрессия рекомбинантных гибридных белков и их ренатурация
2.11.1. Экспрессия рекомбинантных белков
2.11.2. Гибридные белки
2.11.3. Проблемы, возникающие при экспрессии гибридных белков
2.11.4. Расщепление гибридных белков
2.11.5. Тиоредоксин в качестве белка-носителя в составе гибридных
белков
2.11.6. Ренатурация рекомбинантных белков
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Материалы
3.1.1. Реактивы и ферментные препараты
3.1.2. Штаммы и плазмидные вектора
3.1.3. Синтетические олигонуклеотиды
3.1.4. Клеточные линии и питательные среды для роста клеток

3.2. Методы
3.2.1. Конструирование плазмидной ДНК pET-32/TRAIL
3.2.2. Сайт-направленный мутагенез
3.2.3. Получение компетентных клеток E.coli BL21(DE3)
3.2.4. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК
3.2.5. Выделение плазмидной ДНК
3.2.6. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
3.2.7. Определение концентрации белка в растворе
3.2.8. Электрофоретический анализ белка в полиакриламидном геле
3.2.9. Экспрессия TRAIL и его мутантных вариантов
3.2.10. Ренатурация гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя
3.2.11. Очистка и расщепление белка
3.2.12. Идентификация белков по N-концевой последовательности
3.2.13. Кристаллизация и рентгеноструктурный анализ рекомбинантного TRAIL
3.2.14. Определение гомогенности белковых препаратов методом аналитического ультрацентрифугирования
3.2.15. Определение индукции апоптоза в линиях раковых клеток
3.2.16. Определение констант диссоциации для связывания белка с рецептором методом поверхностного плазмонного резонанса
3.2.17. Определение выхода цитохрома с из митохондрий
3.2.18. Вестерн-блот
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Получение рекомбинантного цитокина TRAIL
4.1.1. Синтез гена TRAIL (114-281) и клонирование его в экспрессионный вектор
4.1.2. Экспрессия гибридного белка Trx/TRAIL в E.coli
количествах. Конститутивная экспрессия TRAIL наблюдается в NK-клетках печени мышей [80] и сильно возрастает при стимуляции их интерфероном IFNy и другими цитокинами, например, интерлейкинами [75, 76]. Скорее всего, экспрессия TRAIL в NK-клетках печени регулируется секрецией интерферона-у (IFN- у) по аутокринному типу [80]. Кроме того, экспрессия TRAIL обнаружена в IFNy-активизируемых человеческих периферийных Т-клетках крови [76], дендритных клетках CD11C+h моноцитах [81, 82]. Было показано, что стимуляция дендритных клеток интерфероном-Р приводит к экспрессии TRAIL этими клетками, повышая цитотоксичность дендритных клеток по отношению к раковым клеткам [83]. Таким образом, TRAIL играет роль в регуляции иммунного ответа с участием интерферонов, NK-клеток и дендритных клеток.
Многочисленные исследования указывают на важную роль TRAIL в удалении выполнивших свою функцию лимфоцитов в печени [80]. Предполагается, что TRAIL обеспечивает защиту клеток в местах особой иммунной устойчивости, например, в глазу [84] или синцитиотрофобласте плаценты [85]. Отдельные исследования указывают на участие TRAIL в негативной регуляции эритропоэза [86], индукции апоптоза и экспрессии, воспалительных факторов в эндотелиальных клетках. [87], реовирус-индуцированном апоптозе [88], ангиогенезе и транскрипции различных регуляторных генов [89].
2.7.2. Иммунный контроль организма над первичным развитием опухоли и метастазированием
Исследования на TRAIL-дефицитных мышах подтверждают роль TRAIL в супрессии воспаления и метастазирования во многих тканях in vivo [90]. Экспериментальные мыши с нокаутом по гену TRAIL более подвержены возникновению спонтанных и индуцированных опухолевых метастаз, чем мыши с интактным геном TRAIL [91]. Например, мыши,