Роль лейкемия ингибирующего фактора в процессах роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и в раннем эмбриогенезе

• Автор: Межевикина, Людмила Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 254 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Соматические и эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)
1.1.1. Способы выделения ЭСК из ранних зародышей
1.1.2. Морфофункциональные характеристики ЭСК мыши
1.1.3. Поддержание плюрипотентного потенциала ЭСК in vitro
1.1.4. Факторы, определяющие плюрипотентный статус ЭСК
1.1.5. ЭСК приматов и человека
1.1.6. Спонтанная дифференцировка в эмбриоидные тела (ЭТ)
1.1.7. Индукция дифференцировки в ЭСК in vitro
1.2. Цитокины семейства интерлейкина-6 (IL-6)
1.2.1. Механизмы действия на стволовые клетки
1.2.2. Свойства цитокина LIF
1.2.3. Молекулярная структура LIF
1.2.4. Изоформы LIF, взаимодействие с мембранными рецепторами
1.2.5. Молекулярные механизмы LIF
1.2.6. Пути передачи сигнала LIF в стволовые клетки
1.3. Функции LIF в эмбриогенезе млекопитающих
1.3.1. Участие в процессах имплантации
1.3.2. Механизмы действия LIF в трофобласт-эндометриальной области
1.3.3. Влияние LIF на эмбриональное развитие
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследования
2.2. Клонирование кДНК гена lif мыши
2.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.2. Определение последовательности гена lif
2.3. Получение LIF мыши в бактериальных системах экспрессии
2.3.1. Белковый электрофорез в ПААГ
2.3.2. Диализ рекомбинантного белка L1F
2.3.3. Иммуноблоттинг (WESTERN-блот)
2.3.4. Иммуноферментный анализ (ИФА)
2.4. Трансфекция клеток линии Cos-1 плазмидным вектором со

встроенным геном lif мыши
2.5. Трансфекция ЭСК мыши плазмидным геном lif мыши
2.5.1. Выявление мРНК LIF в трансфицированных ЭСК, зародышах и ^ _ тканях матки
2.5.2. ОТ ПЦР и подбор праймеров
2.5.3. Режим ОТ ПЦР |
2.5.4. Оценка продуктов ПЦР-амшшфикациИ'
2.6. Выделение и культивирование зародышей мыши
2.6.1. Оценка жизнеспособности in vitro
2.6.2. Выделение из бластоцист мышей эмбриональных клеток (ЭК)
2.6.3. Первичные эмбриональные фибробластьт(ПЭФ) мыши
2.7. Культивирование ЭСК •
2.8. Оценка плюрипотентного потенциала ЭСК
2.8.1. Морфологический критерий
2.8.2. Пролиферативная и метаболическая активность
2.8.3. Выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ)
2.8.4. Иммуноцитохимический анализ '
2.9. Оценка структурно-функционального состояния ЭСК
2.9.1. Определение вязкости плазматических мембран
2.9.2. Скорость потребления кислорода и содержание АТФ
2.9.3. Распределение ЭСК по фазам клеточного цикла
2.9.4. Исследование вне- и внутриклеточного кальция и фосфоинозитольной сигнальной системы (PI)
2.10. Цитогенетический анализ
2.11. Индукциядифференцировка ЭСК мыши в кардиомиоцигы
2.12. Микроинъекция (МИ) растворов LIF в полость бластоцисты
2.13. Электрофизиологические на бислойных липидных мембранах (БЛМ)
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Рекомбинантные белки LIF мыши из бактериальных и эукариотических продуцентов
3.1.1. Экспрессия гена lif мыши в бактериальных клетках ]
3.1.2. Продукция рекомбинантного LIF мыши в эукариотических клетках линии Cos-
3.2. Сравнение биологической активности LIF из разных систем экспрессии

3.2.1. Механизмы действия LIF на клеточные мембраны
3.2.2. Влияние L1F на морфофункциональные свойства ЭСК в системе i vitro
3.2.3. Апоптоз и клеточные циклы ЭСК
3.3. LIF-сигнальная трансдукция в ЭСК
3.3.1. Роль ионов кальция в процессах пролиферации ЭСК мыши и ^ человека
3.3.2. Структурно-функциональные изменения в ЭСК мыши при ^ совместном действии LIF и фактора стволовых клеток (SCF)
3.3.3. Индукция дифференцировки в кардиомиоциты
3.4. Кариотипическая эволюция ЭСК мыши in vitro
3.4.1. Эндогенный LIF и его значение для поддержания плюрипотентнь свойств ЭСК
3.4.2. Нарушение хромосомного баланса
3.5. Оценка роли LIF в раннем эмбриогенезе
3.5.1. Влияние LIF развитие зародышей мыши in vitro
3.5.2. Значение внутриклеточного кальция и фосфаинозитолыюй (PI)

сигнальной системы на ранних стадиях развития
3.5.3. Первичные колонии ЭК как модель для исследования ^ ^ регуляторных факторов в период имплантации
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. ЛИТЕРАТУРА

Другой характерной чертой ЭСК приматов и человека является отсутствие зависимости от регуляторного фактора LIF. Полагают, что это связано с их происхождением из эпибласта зародышей на постимплантационных стадиях развития (Thompson et al., 1998; Ginis et al.5 2004; Hanna et al., 2010). Такие стволовые клетки активируются, другими сигнальными молекулами и, возможно, у них доминируют несколько, иные механизмы регулирования плюрипотентных свойств in vitro.
В частности, плюрипотентность ЭСК приматов может поддерживаться за счет трипсин-чувствительного фактора GCT44, выделенного из, клеток человеческой карциномы желточного мешка (Thompson et al., 1998). Однако кондиционированные среды на клетках GCT44 не подавляют цитодифференцировку ЭСК приматов и не обеспечивают их рост в виде колоний. Это наводит на мысль, что .ростовой фактор GCT44 либо неустойчив и быстро инактивируются в среде культивирования; либо он связывается клеточными мембранами и внеклеточным матриксом фидера.
Критерием плюрипотентного статуса разных видов ЭСК является высокая транскрипционная активность факторов Oct3/4, Nanog, Sox2, STAT3, а также активность эндогенных щелочных фосфатаз - ЭЩФ (табл. 2). При переходе клеток от состояния плюрипотентности к дифференцировке активность и соотношение этих факторов резко меняются (Niwa et al., 2000, Choo et al., 2004; Matin et al., 2004; Gerrard et al., 2005; Thomson et al., 2011). Если транскрипционная активность Oct3/4 в стволовых клетках высокая; они развиваются в направлении эндодермальных и мезодермальных производных, при снижении - запускаются процессы дифференцировки в трофоэктодерму. Показано, что-путем подавления экспрессии Oct3/4 можно изолировать из популяций ЭСК трофоэктодермальные линии клеток (Niwa et al., 2000).
При подборе оптимальных условий плюрипотентные ЭСК человека и приматов спонтанно дифференцируются в ЭТ. Теоретически из ЭТ можно получить разные типы клеток взрослого организма. В настоящее время