Кинетические закономерности катализа и инактивации фермента простагландин H синтазы

• Автор: Филимонов, Иван Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 165 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Свойства фермента РвЖ

1.1 Биологическая роль РОЖ

1.2 Структура РОЖ

1.3 Каталитические свойства РОЖ

Глава 2. Критический анализ современного состояния проблемы

2.1 Механизм циклооксигеназной реакции РОЖ

2.2 Механизм пероксидазной реакции РОЖ

2.3 Взаимодействие пероксидазной и циклооксигеназной активностей
2.4 Бифункциональные ферменты
2.5 Инактивация РОЖ в ходе катализируемых реакций
2.6 Кинетический механизм инактивации РОЖ
2.7 Исследование РОЖ методами масс-спектрометрии
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Материалы и методы
3.1 Материалы
3.2 Методы
3.2.1 Получение РОЖ
3.2.2 Очистка РОЖ
3.2.3 Определение белка
3.2.4 Осаждение белка
3.2.5 Электрофорез в полиакриламидном геле
3.2.6 Гидролиз белков в ПААГ
3.2.7 Получение масс-спектров
3.2.8 Определение активностей РОЖ
3.2.9 Обработка кинетических кривых
3.2.10 Приготовление растворов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Теоретические основы обработки результатов
4.1 Проблема интерпретации экспериментальных данных
4.2 Анализ математической модели фермента, подверженного необратимой инактивации в ходе катализируемой реакции
4.2.1 Модель фермента, подверженного необратимой инактивации в ходе катализируемой реакции
4.2.2 Оценка характерных времен тЕ, тх, т1Паа
4.2.3 Достижение стационарных состояний по активным формам фермента при расходовании субстрата и инактивации фермента в ходе реакции
4.2.4 Связность интермедиатов как критерий кинетического поведения механизма ферментативной реакции
4.2.5 Изменение концентрации субстрата и инактивация фермента в ходе
реакции
Глава 5. Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазной реакций, катализируемых ферментом РСНБ
5.1 Молекулярный кислород (субстрат циклооксигеназной реакции) в кинетическом механизме бифункционального фермента простагландин Н синтазы
5.1.1 Влияние типа донора электронов на качественный вид зависимости скорости циклооксигеназной реакции от концентраций кислорода
5.1.2 Зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации кислорода при различных концентрациях арахидоновой кислоты
5.1.3 Зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации
кислорода при разных концентрациях донора электронов (адреналина)
5.1.4. Зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации
арахидоновой кислоты в присутствии и в отсутствие донора электронов
5.2 Пероксидазная активность бифункционального фермента простагландин
Н синтазы
5.2.1 Зависимость скорости пероксидазной реакции от концентрации перекиси водорода

5.2.2 Зависимость скорости пероксидазной реакции от концентрации ТМРБ
при различных концентрациях перекиси водорода
Глава 6. Построение кинетической модели бифункционального
фермента РСНв
Глава 7. Методы определения параметров инактивации фермента РСНв.
Практическое применение результатов теории
7.1. Определение параметров инактивации фермента РОИ8 в случае малого расходования субстрата за время реакции
7.2 Определение параметров инактивации фермента РвНЗ при существенном расходовании субстрата за время реакции
7.3 Сравнение методов расчета параметров инактивации на модельном
эксперименте
Глава 8. Кинетические закономерности инактивации фермента РСН8 в ходе циклооксигеназной и пероксидазной реакций
8.1 Кинетические закономерности инактивации фермента РСНЯ в ходе циклооксигеназной реакции
8.2 Кинетические закономерности инактивации фермента РйНЗ в ходе пероксидазной реакции
8.3 Анализ экспериментальных данных в терминах связности
Глава 9. Масс-спектрометрические исследования РвНв
9.1 Изменение массы молекулы РОНЗ в ходе катализируемых реакций
9.2 Разработка и оптимизация методов пробоподготовки для исследования фермента РвШ методами масс-спектрометрии
9.3 Сравнение методов пробоподготовки фермента РОНЭ для масс-спектрометрических исследований
9.4 Масс-спектр белка, обработанного трипсином
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

содержат как минимум два активных центра и катализируют, как правило, две последовательные реакции [99, 100]. Эти особенности потенциально позволяют бифункциональным ферментам проявлять ряд новых специфических свойств. Во-первых, это возможный дрейф интермедиата (продукт первой реакции, он же субстрат второй реакции) между двумя активными центрами, без выхода интермедиата в раствор [100-102]. Во-вторых, состояние активного центра первой реакции может влиять на кинетические свойства активного центра второй реакции и наоборот [99, 100]. Для тимидилатсинтазы-дигидрофолатредуктазы из Leishmania major [99] и из Toxoplasma gondii [103], триптофансинтазы из Salmonella typhimurium [104], диметилглициноксидазы из Arthrobacter globiformis [105] установлено наличие дрейфа интермедиата, в то время как для тимидилатсинтазы-дигидрофолатредуктазы из Cryptosporidium hominis [106], ацетилтрансферазы-урилилтрансферазы из Escherichia сої і [107] такой дрейф отсутствует. Для тимидилатсинтазы-дигидрофолатредуктазы из L. major [99], карбамоилфосфатситетазы из Е. coli [108], глутамин фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы из Е. coli [109] отмечено влияние протекания одной реакции на кинетику другой реакции, в то время как для тимидилатсинтазы-дигидрофолатредуктазы из С. hominis [106] и из Т. gondii [110] такое влияние не обнаружено. Заслуживает также внимания сообщение [111] о преимущественной конверсии эндогенного интермедиата (простагландина G2) микросомальным бифункциональным ферментом простагландин Н синтазой и об исчезновении этого эффекта в случае применения очищенного фермента.
Указанные особенности кинетического поведения бифункциональных
ферментов должны иметь адекватное кинетическое описание. Попытки
описать кинетические особенности бифункциональных ферментов
предпринимались неоднократно. В работах [112, 113] решались проблемы
описания лаг-периодов и концентраций промежуточных продуктов при