Фенотипический и генетический анализ вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae 0139

• Автор: Осин, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 171 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Генетические и биохимические особенности штаммов
V. скокгае 0139 различной вирулентности
1.2. Горизонтальный перенос основных генов вирулентно-
сти и его роль в формировании вирулентных штаммов холерного вибриона
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Питательные среды и реактивы
2.3. Методы
2.3.1. Получение мутантов с помощью индуцированного му-
тагенеза и определение их питательных потребностей и способности к продукции гемолизина и капсулы
2.3.2. Конъюгационные скрещивания
2.3.3. Определение чувствительности культур к холерным фагам

2.3.4. Определение продукции маннозо-чувствительных ге-
магглютинирующих пилей адгезии (МЧПА)

2.3.5. Определение подвижности
2.3.6. Электронно-микроскопический анализ холерных вибрионов
2.3.7. Определение продукции фосфолипазы и гемагглюти-нин/протеазы и гемолизина
2.3.8. Изучение плазмидного состава штаммов V. скок гае 0
2.3.9. Полимеразная цепная реакция
2.3.10. Определение продукции холерного токсина
2.3.11. Определение вирулентности
2.3.12. Электрофоретический анализ белков
2.3.13. Выделение фаговой ДНК
2.3.14. Гибридизация по Саузерну и риботипирование
ГЛАВА 3. ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ V СНО-
ЬЕК4Е 0139 РАЗЛИЧНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ
3.1. Определение продукции капсулы и 0139 антигена у штаммов V. ско/егае 0
3.2. Сравнительный анализ питательных потребностей, подвижности, продукции пилсй адгезии и устойчивости к антибиотикам У.скокгае 0139 у штаммов с различной вирулентностью
3.3. Сравнительный анализ белков внешней мембраны, продукции ферментов патогенности (протеазы, фосфолипазы) и гемолизина у штаммов У скокгае 0139, вы-
ГЛАВА 4.

ГЛАВА 5.

деленных из разных ис точников
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА ВИРУЛЕНТНЫХ И АВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ V CHOLERAE

Изучение структурной организации участков хромосомы вирулентных штаммов 0139 серогруппы V. cholerae Р16064 и Р16131, содержащих гены ctxAB, кодирующих
биосинтез холерного токсина
Генное зондирование штаммов V cholerae 0139 для выявления в их хромосоме структурных и регуляторных генов вирулентности, а также инсерционной последовательности RS1 и генома умеренного фага
Сравнительный ПЦР-анализ структуры генома вирулентных и авирулентных штаммов V cholerae серогруппы 0
ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИОБРЕТЕНИЯ АВИРУ-ЛЕНТНЫМИ ШТАММАМИ V. CHOLERAE 0139 ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ ОТ ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ
Особенности наследования и экспрессии в клетках ави-рулентного штамма V. cholerae 0139 рекомбинантной
плазмиды с генами холерного токсина
Обмен хромосомными генами между вирулентными и

К настоящему времени получены данные, подтверждающие гипотезу о поликлональном происхождении штаммов 0139 серогрупны. С помощью сравнительного анализа фрагментов шести «housekeeping» генных локусов, расположенных на двух хромосомах V. cholerae 0139, было выявлено три удаленных друг от друга клона V. cholerae 0139 серогруппы. Эти данные могут свидетельствовать о существовании трех различных источников возникновения штаммов V. cholerae 0139, выделенных в период с 1992 по 1993 гг. [Farfan М. et al., 2002].
Первая эпидемия холеры, вызванная возбудителем 0139 серогруппы, стала угасать в июне 1993 года и вибрионы Бенгал стали замещаться на типичные для этого района штаммы V. cholerae биовара эльтор. Однако после небольшого перерыва в 1996 году в Калькутте снова были зарегистрированы случаи заболевания, вызванные вибрионами 0139 серогруппы [Faruque S. М., 1996; Albert М. J. et al., 1997]. Детальное изучение выделенных в этот период штаммов показало, что в структуре генома появились некоторые особенности, отсутствующие у вибрионов 0139 серогруппы, выделенных до этого периода. В частности, было выяснено, что присутствующий в этих новых штаммах С ГХ профаг отличается по своей структуре от такового, содержащегося в хромосоме вибрионов эльтор [Davis В. М. et al., 1999]. Каковы же особенности профага СТХ имеющегося в хромосоме калькуттских штаммов V. cholerae 0139?
Известно, что основным фактором вирулентности V cholerae является холерный токсин (XT), поражающий клетки эпителия кишечника [Sears C. L., Kaper J. В., 1996]. Холерный токсин, продуцируемый V. cholerae после колонизации тонкого кишечника, вызывает основной симптом холеры - диарею [Levine М. М. et al., 1983]. В 1996 году М. K. Waldor, и J. J Mekalanos впервые показали, что гены, ко-