Молекулярно-биологические особенности вируса гепатита B дикой и мутантной форм в трех регионах Российской Федерации

• Автор: Писарева, Мария Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 110 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВГВ - вирус гепатита В
ХГВ - хронический вирусный гепатит В
ХВГ - хронический вирусный гепатит.
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism - полиморфизм длин
рестрикционных фрагментов
кзкДНК - ковалентно-замкнутая кольцевая ДНК
и.о. - пары нуклеотидных оснований
а.к. - аминокислота, аминокислотный остаток
ОРС - открытая рамка считывания
ПИР - полимеразная цепная реакция
JIMB - ламивудин
пгРНК - прегеномная РНК
ЭР - эндоплазматический ретикулум
ПВО - первичный вирусологический ответ.
СВО - стойкий вирусологический ответ.
1IBT - противовирусная терапия.
ЦП - цирроз печени.
HBcorAg - ядерный антиген вируса гепатита В.
HBeAg - е-антиген вируса гепатита В.
HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В.
ВГВ - вирус гепатита В.
AbHBs - антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В.
АЬНВе - антитела к е-антигену вируса гепатита В.
AbHBcorlgM, AbHBcorlgG - антитела IgM и IgG к ядерному антигену вируса гепатита В.
ИГА - индекс гистологической активности.

1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Молекулярная биология ВГВ
2.1.1. Структура и организация генома
2.1.2. Вирусные белки
2.1.3. Жизненный цикл ВГВ
2.1.4. Репликация ВГВ
2.1.5. Серологические маркеры инфекции ВГВ
2.2. Молекулярные варианты ВГВ
2.2.1. Генотипы ВГВ
2.2.2. Сочетанное инфицирование различными генотипами

2.2.3. HBeAg варианты и HBeAg-cepoнегативность
2.2.4. HBsAg варианты и уход от иммунного ответа
2.2.5. Мутанты pre-core и core гена
2.2.6. Мутации устойчивости к ламивудину и другим нуклеозидным аналогам
3. Материалы и методы
4. Результаты собственных исследований
4.1. Генотипирование ВГВ в популяциях больных гепатитом В в Санкт-Петербурге, Петрозаводске и Якутии
4.2. Выявление мутантных форм вируса гепатита В
4.3. Выявление мутаций в YMDD-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В
4.4. Анализ аминокислотных замен
5. Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы

1. Введение
Актуальность проблемы
Вирус гепатита В (ВГВ) является одним из самых распространенных гепатотропных вирусов, вызывающих хроническое поражение печени (Балаян М.С. и Михайлов М.И., 1999; Львов Д.К., 2000; Шахгильдян И.В., 2001; Ивашкин В.Т., 2002). Несмотря на программу вакцинации против ВГВ в России распространенность ВГВ-инфекции продолжает неуклонно возрастать. Клинические проявления хронического вирусного гепатита (ХВГ) многообразны и зависят в основном от биологических свойств вируса и особенностей его взаимодействия с иммунной системой хозяина (Oldstone
S.etal., 1991).
Антигенная специфичность белковых структур ВГВ определяется генотипической принадлежностью вирусов и возникающими мутациями, которые меняют фенотип вируса и влияют на течение ХВГ (Brunetto M.R. et al„ 1999; Chan H.L. et aL, 2002; Sumi H. et al., 2003; Norder H., 2004; Hunt C.M. et al., 2004; Baumert T.F. et al., 2005). Вирус гепатита В считается наиболее изученным среди остальных вирусов гепатита. Однако в последнее десятилетие возрос интерес к влиянию генетической вариабельности ВГВ на течение и исход болезни. Генетическая вариабельность проявляется как в возникновении мутаций в вирусном геноме у каждого инфицированного субъекта, так и в существовании различных генотипов ВГВ, свойственных определенным популяциям носителей.
Современная классификация ВГВ включает восемь генетических групп, обозначенных латинскими буквами от А до Н (Schaefer S., 2007). В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что генотип ВГВ может влиять на скорость сероконверсии е-антигена, тяжесть течения болезни, частоту хронизации и вероятность развития гепатокарциномы (Buti М. et al., 2005). Кроме того, ответ на антивирусную

4. Результаты собственных исследований
4.1. Генотипирование ВГВ в популяциях больных хроническим гепатитом В в Санкт-Петербурге, Карелии и Якутии
В последнее десятилетие ведутся интенсивные исследования генотипов и вариантов ВГВ циркулирующих в различных регионах мира. К настоящему времени накоплено значительное количество данных, указывающих на то, что вирусная гетерогенность является важным фактором, влияющим на течение заболевания и антивирусную терапию.
Хотя в последние годы анализу геномных последовательностей значительно способствовало появление и развитие автоматических секвенаторов, тем не менее, секвенирование до сих пор остается дорогостоящим, трудоемким и недоступным для многих исследовательских лабораторий. По этой причине неоднократно предпринимались попытки использовать различные методы, основанные на ПЦР, такие как использование типоспецифичных праймеров (Norder H. et al., 1990; Repp R. et al„ 1993) и RFLP (Shih J. et al., 1991; Lindh M. et al, 1997; Lindh M. et al., 1998), для генотипирования ВГВ. Однако, только в последних двух упомянутых работах были идентифицированы все известные генотипы, и корректность результатов была продемонстрирована на большом количестве образцов.
Генотипирование ВГВ по участку pre-S проводили по методу, предложенному Линдом (Lindh et al., 1998). Метод основан на амплификации сегмента, расположенного между 2823 и 80 нуклеотидами генома ВГВ с последующей инкубацией амплификата с рестриктазами Eco47I (Avail) и Mbol (DpnII). Размеры образующихся рестрикционных фрагментов представлены в таблице 6. Метод позволяет идентифицировать все известные генотипы.
Для генотипирования ВГВ по участку гена S использовали метод аналогичный методу Линда (Lindh et al., 1997), однако, отличающийся от него в некоторых деталях. ПЦР проводили с праймерами S1 и S2, которые используются нами для рутинной диагностики ВГВ.