Организация биодеградативных путей у родококков

• Автор: Соляникова, Инна Петровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 245 с. : ил.

Список сокращений:
Ферменты:
ДЛГ, диенлактонгидролаза;
МАР, малеилацетатредуктаза;
МЛИ, муконолактонизомераза;
МЦИ, муконатциклоизомераза;
МЛДГ, муконолактон дегалогеназа;
ФГ, фенолгидроксилаза;
ПК 1,2-ДО, пирокатехин 1,2-диокси геназа;
ПОБГ, иоря-гидроксибензоат гидроксилаза;
ПКК ДО, протокатехоат диоксигеназа
(Х)ГГХ 1,2-ДО, (хлор)гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназа;
ХМЦИ, хлормуконатциклоизомераза;
ХПК 1,2-ДО, хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа;
ЗХПК 1,2-ДО, хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа модифицированной 3-хлорпирокатехиновой ветви 1{.орасш 1СР;
4ХПК 1,2-ДО, хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 4-хлорпирокатехи новой Я.орасш 1СР
Соединения:
2,4-Д, 2,4-дихлорфеноксиацетат;
ПАВ, поверхностно-активные вещества ПКК, протокатеховая кислота ПХБФ, полихлорбифенилы ПОБК, иаря-гидроксибензоат;
(Х)ГГХ, (хлор)гидроксигидрохинон «ХМБ, шра-хлормеркурибензоат;
4-МБК, 4-метилбензоат = иоря-толуат;
3-ХБК, 3-хлорбензоат;
4-ХБК, 4-хлорбензоат;
ПГБК, няря-гидроксибснзоат;
2-ХМ, 2-хлормуконат;
2-ХМЛ, 2-хлормуконолактон;
5-ХМЛ, 5-хлормуконолактон;
4-ХПК, 4-хлорпирокатехин;
3-ХПК, 3-хлорпирокатехин;
2-ХФ, 2-хлорфенол;
4-ХФ, 4-хлорфенол;
ОТТ - дитиотреитол
ІРТЄ, ІБорго руї- р-О-Дп одаїасіоругапозібе Х-да1, 5-Ьгото-4-сЫого-3 -іпбоїуі-р-б^аіасюзібе БОБ - додецил сульфат натрия;
Список сокращений
1. Введение
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Состояние вопроса
1.3. Цель и задачи исследования
1.4. Научная новизна
1.5. Практическая значимость
1.6. Связь работы с крупными программами
1.7. Апробация работы
Благодарности
2. Обзор литературы «Аэробное разложение (хлор)ароматических соединений бактериями»
Глава 1. Аэробное разложение ароматических соединений грам-отрицательными бактериями
2.1.1. Штаммы-деструкторы хлорфенолов
2.1.2. Подготовительные этапы разложения моно-полигалогенированных фенолов, фенолгидроксилазы
2.1.3. Основные пути разложения (хлор)пирокатехинов
2.1.3.1. метя-Расщепление пирокатехинов
2.1.3.2. орото-Расщепление (хлор)пирокатехинов
2.1.4. Гидроксигидрохиноновый путь расщепления
Глава 2. Генетические основы разложения ксенобиотиков микроорганизмами
Глава 3. Родококки как биодеструкторы ксенобиотиков
3. Методу и материалы
3.1. Организмы, методы их культивирования
3.2. Клонирование генов 3-ХПК катаболизма у Я. орасш 1 ср
3.3. Приготовление бесклеточных экстрактов
3.4. Определение активности ферментов
3.4.1. Спектрофотометрическое определение активности ферментов
3.4.2. Определение активности ферментов методом фтористого ядерно-магнитного резонанса
3.5. Анализ образующихся метаболитов методом ВЭЖХ
3.6. Анализ образующихся метаболитов методом УФ-спектроскопии
3.7. Нативный и БПБ-электрофорез
3.8. Определение Ц-концевой аминокислотной последовательности и
аминокислотного состава
3.9. Очистка ферментов
3.9.1. Очистка ферментов из биомассы штамма Я. орасия 1ср, выращенной на бензоате
.« 3.9.1.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа
3.9.1.2. Муконатциклоизомераза
3.9.2. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте Я. ораст 1ср на 2-хлорфеноле
3.9.2.1. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ
3.9.2.2. Хлормуконатциклоизомераза
3.9.2.3. Хлормуконолактондегалогеназа
3.9.2.4. Диенлактонгидролаза
3‘9.3. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus 1ср на 4-хлорфеноле
З.9.З.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа
3.9.3.2. Хлормуконатциклоизомераза
3.9.3.3. Диенлактонгидролаза
3.9.4. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus 1ср на 4-метилбензоате
3.9.4.1. Пирокатехин диоксигеназа I
3.9.4.2. Пирокатехин диоксигеназа II
3.9.4.3. Муконатциклоизомераза
3.9.5. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте штамма R. rhodochrous 89 на феноле
3.9.5.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа
3.9.5.2. Муконатциклоизомераза
3.9.6. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте штамма R. rhodnii 135 на феноле
■- 3.9.6.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа
3.9.7. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. ruber Р25 на различных ароматических субстратах
3.9.7.1. Очистка л-гидроксибензоат гидроксилазы
3.9.7.2. Очистка протокатехоат диоксигеназы
3.9.7.3. Очистка ферментов из биомассы, выращенной на л-толуате 73 ЗЛО.Влияние ЭДТА и л-ХМБ на активность ферментов
3.11. Определение кинетических характеристик ферментов
3.12. Кристаллизация белков из R. opacus 1ср
3.12.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа
3.12.2. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа
3.12.3. Рентгено-структурный анализ кристаллов
4. Результаты и обсуждение
4.1. Оценка роста родококков на различных ароматических субстратах
4.1.1. Морфологическая диссоциация R. opacus 1ср при росте на (хлор)ароматических соединениях
4.2. Конверсия фторфенолов родококками
4.3. Ферменты обычного орто-пути, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus lcp на бензоате
4.3.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа
4.3.2. Муконатциклоизомераза
4.4. Ферменты орто-пут, индуцирующиеся при росте штамма R.opacus lcp на 4-метилбензоате (ляря-толуате)
4.4.1. пирокатехин 1,2-диоксигеназа I
4.4.2. пирокатехин 1,2-диоксигеназа II
4.4.3. муконатциклоизомераза
4.5. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма R.opacus lcp на 4-хлорфеноле
4.5.1.4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа
4.5.2. Хлормуконатциклоизомераза
4.5.3. Диенлактонгидролаза
4.6. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus lcp на 2-хлорфеноле

диоксигеназа; б - бифенилдигидродиол дегидрогеназа; в - гидроксибифенил 2,3-диокси-геназа; г - ГОФДК гидролаза.
Заметим, что до недавнего времени не было выделено чистых культур бактерий, способных полностью разлагать ПХБФ, весь процесс, катализируемый микробными сообществами, проходит в два этапа - на первом идет превращение ПХБФ до хлорбензойных кислот, на втором - разложение хлорбензойных кислот [Shiaris & Sayler, 1982; Fumkawa et al., 1979].
Представители рода Rhodococcus на настоящий момент оказались чуть ли не единственными микроорганизмами, способными к разложению ряда ПХБФ: Rhodococcus globerulus Р6 [Asturias & Timmis, 1993; Asturias et al., 1994b], Rhodococcus erythropolis TA421 [Cnung et al., 1994; Maeda et al., 1995], Rhodococcus sp. M5 [Furukawa, 1994; Wang et al., 1995], Rhodococcus sp, RHA1 [Seto et al., 1995; Yamada et al., 1998] и Rhodococcus ruber P25 [Рыбкина с соавт., 2003]. Способность этих штаммов разлагать хлорированные бифенилы варьировала от кометаболизма ПХБФ (R. erythropolis ТА421) до разложения три-, тетра- и пентахлорбифенилов (штамм RHA1), что определяется субстратной специфичностью ферментов, вовлеченных в процесс деструкции [Barriault et al., 1999; Fortin et al., 2005]. Большинство публикаций по теме касается в основном клонирования генов, кодирующих ферменты, ответственные за первые четыре этапа превращения (ПХ)БФ - мультикомпонентную бифенил диоксигеназу (BphA), дигидродиол дегидрогеназу (BphB), 2,3-дигидроксибифенил диоксигеназу (BphC) и гидролазу (BphD), которые объединяются в кластер и транскрибируются как оперон [Abramowicz, 1990; Asturias et al., 1994a; Masai et al., 1995]. Интересной чертой штаммов R. globerulus P6 и R. erythropolis TA421 является присутствие, соответственно, трех и семи генов, кодирующих дигидроксибифенил диоксигеназы [Asturias & Timmis, 1993; Maeda et al., 1995; Kosomo et al., 1997]. На основании изучения распределения этих множественных генов среди родококков и обнаружения их не только на хромосоме, но и на плазмидах, Косоно с соавт. [Kosono et al., 1997] сделали вывод, что плазмиды играют важную роль в эволюции путей катаболизма устойчивых соединений у грам-положительных бактерий.
Родококки способны разлагать, помимо бифенилов, нафталин [Larkin et al., 1999] и полиароматические соединения.
- Использование родококков в природоохранных мероприятиях. Препараты на основе родококков успешно используются для очистки загрязненных почв. Так было получено значительное увеличение уровня разложения пентахлорфенола в песчаной почве при инокулировании ее штаммом R. chlorophenolicus [Briglia et al., 1994]. Штамм