Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани

• Автор: Ефименко, Анастасия Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 165 с. : 15 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.Терапевтический ангиогенез: основные подходы
1.2.Использование МСК жировой ткани для стимуляции ангиогенеза
1.3. Старение МСК
1.4.Персонализированный подход к клеточной терапии с использованием аутологичных
МСК-ЖТ
Заключение обзора литературы
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование
2.2.Экспериментальные животные
2.3.Выделение МСК из жировой ткани
2.4.Культивирование МСК-ЖТ
2.5.Моделирование гипоксии
2.6.Характеристика МСК-ЖТ
2.6.1.Анализ экспрессии маркеров МСК на поверхности клеток
2.6.2. Оценка способности клеток к остеогенной и адипогенной дифферет^ровке в индуктивных средах роста
2.6.3. Оценка жизнеспособности клеток
2.6.4. Оценка пролиферации клеток
2.6.5. Определение относительной длины теломер в клетках
2.7.Оценка продукции активных форм кислорода в МСК-ЖТ
2.8.Выделение РНК из клеток
2.9. Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени
2.9.Сравнительная оценка транскриптома МСК-ЖТ человека, культивированных в стандартных и гшгоксических условиях
2.10. Оценка экспрессии урокиназного рецептора (uPAR) на поверхности МСК-ЖТ человека
2.11. Анализ содержания факторов роста в кондиционированной среде с помощью
иммуноферментного анализа (ELISA)
2.12.Оценка активности металлопротеиназ 2 и 9 типов (ММП-2 и ММП-9) в кондиционированной среде методом зимографии
2.13.Формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле
2.14.Ангиогенез в подкожном имплантате Матригеля
2.15.Статистический анализ
3.РЕЗУЛЬТАТ Ы

3.1.МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, сравнимы по морфологии, иммунофенотипу и пролиферативной активности, но различаются по накоплению маркеров старения
3.2.Влияние возраста на ангиогенные свойства МСК-ЖТ человека

3.2.1. Образование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками па Матригеле в присутствии кондиционированной среды от МСК-ЖТ пациентов разного возраста
3.2.2. Содержание ангиогенных факторов роста в кондиционированной среде от МСК-ЖТ пациентов разного возраста
3.2.3. Содержание мРНК генов факторов, регулирующих ангиогенез, в МСК-ЖТ пациентов разного возраста
3.3.Влияние возраста на экспрессию и активность протеаз в МСК-ЖТ
3.3.1. Содержание мРНКурокиназы, урокиназного рецептора, ингибитора активатора плазминогена 1 типа и металлопротеиназ 2 и 9 типов в МСК-ЖТ
3.3.2. Экспрессия урокиназного рецептора на мембранной поверхности МСК-ЖТ
3.3.3.Активность ММП-2 и ММП-9 в кондиционированной среде от МСК-ЖТ
3.4.Влияние возраста на ангиогенные свойства МСК-ЖТ мышей
3.4.1.С возрастом пролиферация МСК-ЖТ мышей снижается, а доля апототических клеток в популяции увеличивается
3.4.2.С возрастом продукция активных форм кислорода в МСК-ЖТ мышей и способность клеток к остеогенной дифференцировке усиливается
3.4.3. Способность МСК-ЖТ мышей стимулировать ангиогенез in vitro и in vivo снижается с возрастом
3.4.4.При старении в МСК-ЖТ мышей изменяется профиль экспрессии генов факторов, регулирующих ангиогепез
3.5.Влияние кратковременной гипоксии на ангиогенные свойства МСК-ЖТ при старении..
3.5.1. Гипоксия вызывает изменения профиля экспрессии генов в МСК-ЖТ человека
3.5.2.Гипоксия усиливает способность МСК-ЖТ молодых мышей стимулировать рост кровеносных сосудов на модели подкожной имплантации Матригеля
3.5.3. При старении ответ МСК-ЖТ на гипоксию изменяется
4.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФК — активные формы кислорода
ГМК - гладкомышечные клетки
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
ИБС - ишемическая болезнь сердца
ИМ - инфаркт миокарда
ИМТ - индекс массы тела
кДНК - комплементарная ДНК
ЛЖ — левый желудочек
ЛКА — левая коронарная артерия
мкм - микрометр
ММП - магриксные металлопротеиназы (matrix metallopeptidase)
мРНК - матричная РНК
МРТ - магнитно-резонансная томография
МСК — мезенхимальные стволовые клетки
МСК-ЖТ — мезенхимальные стволовые (стромальные) клетки жировой ткани МСК-КМ - мезенхимальные стволовые (стромальные) клетки костного мозга нг - нанограмм нм - нанометр
отн.ед. - относительные единицы НААГ - полиакриламидный гель ГІКА — правая коронарная артерия ПНА — правая нисходящая артерия ПЦР — полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклуклеииовая кислота СВФ - стромально-васкулярная фракция ФБС — фетальная бычья сыворотка

Мультипотентность
В многочисленных работах показано, что МСК-ЖТ, помимо способности к адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировке, являющейся одним из атрибутивных признаков МСК, могут дифференцироваться в миогенном [Васой, 2004; Di Rocco, 2006], нейрональном [Safford, 2004] направлениях, а также в эндотелиальные, гладкомышечные клетки и даже кардиомиоциты [Rangappa, 2003; Miranville, 2004; Planat-Benard, 2004; Miyahara, 2006; Song, 2007; Jeon, 2008; Kim, 2009; Madonna, 2009; Schcnke-Layland, 2009].
Способность к спонтанной мезенхимальной дифференцировке у МСК-ЖТ и МСК-КМ сравнительно одинакова. Разница между двумя типами клеток появляется при использовании специальных индукционных сред. Так, в среде для остеогенной дифференцировки, активность щелочной фосфатазы (ALP) значительно выше у МСК-ЖТ, а минерализация - у МСК-КМ. Оба типа клеток экспрессируют мРНК коллагена типа I, остеокальцина, остеонектина, остеопонтина, ВМР-1, рецептора паратиреоидных гормонов, витамина D, рецептора ретиноевой кислоты и другие факторы, регулирующие остеогенные гены [Zuk, 2001]. In vitro хондрогенез с помощью МСК-ЖТ и МСК-КМ происходит похожим образом: микромассы обоих типов клеток продуцируют протеогликаны, коллаген II типа, хондроитии-4-сульфат и кератин сульфат, и образуют коллагеновый, а не гиалиновый хрящ [Zuk, 2001; Huang, 2002].
Было показано, что МСК-ЖТ обладают потенциалом к дифференцировке в кардиомиоциты in vitro [Rangappa, 2003; Planat-Benard, 2004]. Rangappa и соавт. первые описали появление спонтанно бьющихся клеток спустя неделю после добавления к МСК-ЖТ 5-азацитидина [Rangappa, 2003]. На второй неделе дифференцировки 30% клеток формировали шароподобные структуры, которые спустя неделю начинали биться спонтанно. По данным иммуногистохимии данные структуры окрашивались на тяжелые цепи миозина, тропонина I и а-саркомерного актинина.