Роль глюкантрансферазы Bgl2p в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей

• Автор: Лауринавичюте, Даниэла Кестуче
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: «Клеточная стенка дрожжей, биосинтез основных компонентов и сборка»
1. Введение
2. Основные этапы биосинтеза глюкана
2.1. Биосинтез Р1 ,б-глюканов
2.2. Регуляция синтеза 31,3-глюкана
2.3. Локализация синтеза рі,3-глюкана
2.4 Модификации 31,3-глюкана
3. Основные этапы биосинтеза хитина
3.1 Биосинтез хитина на протяжении клеточного цикла
3.2. Ферменты, участвующие в биосинтезе хитина в дрожжах
4. Белки клеточной стенки дрожжей
4.1. Модификации белков клеточной стенки дрожжей
4 11 О-гликозилирование
4.1.2. М-гликозилирование
4.1.3. Присоединение гликозилфосфатидилинозитола
4.2. Разнообразие белков клеточной стенки дрожжей
4.2.1. ЗОБ-экстрагируемые белки
4.2.2. Белки, экстрагируемые глюканазами
4.2.3. Белки, экстрагируемые щелочью
4 3 Регуляция биосинтеза белков клеточной стенки дрожжей
4.4. Транспорт маннопротеинов к клеточной стенке дрожжей
4.5. Локализация белков в клеточной стенке дрожжей
5. Связь макромолекул в составе клеточной стенки дрожжей
5.1. Ковалентные связи между компонентами в составе клеточной стенки
дрожжей

5.2. Ферменты, вовлеченные в формирование ковалентных связей между компонентами в составе КС дрожжей
5.3. Роль белков в формировании и поддержании молекулярной организации клеточной стенки дрожжей
6. Биогенез клеточной стенки во времяспецифических программ развития
6.1 Спаривание
6.2. Псевдогифалъный рост
6.3. Споруляция
7. Биогенез клеточной стенки в стрессовых условиях
7 1. Реакция клетки на стресс
7.2 Детекция стресса и передача сигналов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Используемые в работе реактивы
1.1 Используемые в работе штаммы микроорганизмов и условия их выращивания
2. Состав сред, используемых для культивирования микроорганизмов
3.1. Среды для выращивания Е.соИ
3.2. Среды, используемые для выращивания дрожжей
4. Выделение ДНК
4.1 Выделение плазмидной ДНК
4.2 Выделение дрожжевой ДНК
5 Выделение дрожжевой РНК
6. Электрофоретические методы
6 1. Электрофорез в агарозном геле
6.2. Электрофорез в денатурирующих условиях
7 Трансформация клеток микроорганизмов
7 1 Получение компетентных клеток и трансформация Е.соН
7.2. Трансформация дрожжей 5
8. Получение штамма дрожжей 5. сеге^ае с нарушенными генами
ВС12 и СЖЗ
9. ПЦР-амплификация
10. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения
11. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента гена BGL2
12. Гибридизация по Саузерну
13. Нозерн-блот гибридизация
14. Выделение клеточных стенок дрожжей
15. Депротеинизация КС дрожжей с помощью трипсина и проназы, а также NaOH
16. Экстракция белков из КС дрожжей
17. Выделение и анализ белков среды роста дрожжей
17 1 Выделение белков из среды роста дрожжей
17.2. Анализ устойчивости белков среды роста к действию трипсина
18. Получение внутриклеточного содержимого клеток дрожжей
19. Получение антител к белку с молекулярной массой 33 кДа
20. Вестерн-блот анализ
21 Определение количества компонентов в изолированных КС дрожжей
21.1 Определение количества белков в изолированных КС дрожжей
212. Определение количественного содержания полисахаридов КС
21.3. Определение количественного содержания аминосахаров
22. Определение чувствительности клеток дрожжей к различным агентам
22.1. Определение чувствительности клеток к Calcofluor white и Congo red
22.2. Определение чувствительности клеток дрожжей к Никомицину Z
23. Электронная микроскопия клеток и КС дрожжей
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Определение нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок с молекулярной массой 33 кДа КС дрожжей C.utilis, выявление степени гомологии этого белка белку Bgl2p дрожжей S.cerevisiae
2. Сравнительный анализ устойчивости белка Bgl2p в составе КС S.cerevisiae к действию трипсина и проназы
3 Изучение роли белка Bgl2p в формировании структуры КС дрожжей
3.1 Получение штамма дрожжей S.cerevisiae, лишенного гена BGL2
3.2 Изучение роста штамма с нарушенным геном BGL2 (bgl2), а также определение чувствительности к CFW, Congo red и Никкомицину Z
проявляющие значительную гомологию с гликозидазами, обнаруживаются в районах КС, обогащенных хитином (Rodriguez-Pena et al., 2000).
Традиционно, белки КС рассматривались как барьер, обеспечивающий устойчивость КС к литическим ферментам и веществам, нарушающим ее структуру (см. обзоры Orlean, 1997; Lipke & Ovalle, 1998; Kapteyn et al., 1999a) Однако данные о том, что экспрессия некоторых белков КС строго регулируется, а гакже о неравномерном распределении по крайней мере некоторых белков в КС (Rodriguez-Pena et al, 2000), указывают на существование других функций у белков КС Очень перспективным направлением в настоящий момент является изучение их роли в создании полярности и определении морфологии клетки.
5. СВЯЗЬ МАКРОМОЛЕКУЛ В СОСТАВЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ.
Клеточная стенка дрожжей представляет собой прочную и в то же время динамичную структуру, одной из функций которой является поддержание формы клетки. Все компоненты в составе КС связаны между собой с помощью коёалентных и нековалентных связей. Надо сказать, что представления о формировании единого молекулярного ансамбля КС дрожжей значительно расширились благодаря открытию белков, ковалетно связанных с глюкановым каркасом КС
5.1. Ковалентные связи между компонентами в составе клеточной стенки дрожжей. В 1995 в лаборатории Э.Кабиба (США) была детально охарактеризована связь между р1,3-глюканом и хитином КС дрожжей. Тот факт, что Р1,3-глюкан связан с хитином в составе КС дрожжей, и этот комплекс, по-видимому, формирует фибриллярную сеть, определяющую прочностные свойства стенки, был известен достаточно давно (Siestma & Wessels, 1981; Surarit et al., 1988). В работе (Kollar etal, 1995) было показано, что связь между р1,3-глюканом с хитином в КС дрожжей формируется следующим образом: редуцирующий конец хитиновой цепочки посредством ß 1,4-связи присоединяется к нередуцирующему концу Р1,3-глюкана.