Структурно-термодинамические исследования химерных белков на основе спектринового SH3-домена

• Автор: Гущина, Любовь Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 141 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
I. ВВЕДЕНИЕ
И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
П.1. Структура и функции вНЗ-доменов
И. 1.1. Общая характеристика БНЗ-доменов
II. 1.2. Структура Б НЗ-доменов
II.1.3. Спектриновый БНЗ-домен дикого типа и его варианты
П.2. Структурные и термодинамические особенности р-шпилек в изолированном виде и в составе 8НЗ-доменов
И.2.1. Принципы организации изолированной Р-структуры
П.2.2. Химерные формы спектринового 8НЗ-домена типа «Бержерак»
П.З. Анализ структуры комплексов вНЗ-доменов с лигандами
П.3.1. Полипролиновая спираль II
П.3.2. Взаимодействие 8НЗ-доменов с полипролиновыми пептидами
И.З.З. Способность вНЗ-доменов связывать полипролиновые спирали в двух
ориентациях
П.3.4. Энергетика связывания пептидных лигандов 8НЗ-доменами
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1П.1. Материалы
III. 1.1. Химические реактивы, приборы
Ш.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды
1П.2. Методы
Ш.2.1. Методы генной инженерии и микробиологии
Ш.2.2. Биохимические методы
Ш.2.3. Кристаллизация белков и сбор дифракционных данных
Ш.2.4. Спектроскопия ЯМР

НТ.2.5. Физические методы исследования
Ш.2.5.1. Анализ данных сканирующей калориметрии и проверка справедливости модели двух состояний
Ш.2.5.2. Флуоресцентная спектроскопия и применение модели двух состояний к анализу денатурации белков мочевиной
Ш.2.5.3. Более сложные модели равновесных переходов
IV. РЕЗУЛЬАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1У.1. Структурно-термодинамические исследования белков семейства «Бержерак»
IV. 1.1. Кристаллизация белков и исследование их структуры методом РСА
IV. 1.2. Структуры БЫН-ЭНЗ и БНА-БИЗ, определенные методом ЯМР
IV. 1.3. Микрокалориметрические исследования белков «Бержерак»
IV. 1.4. Спектры флуоресценции и разворачивание БНА-БЮ мочевиной
IV. 1.5. Отклонения от одностадийной модели разворачивания
IV. 1.6. Обсуждение результатов исследований белков «Бержерак»
1У.2. Структурно-термодинамические исследования доменов с пришитыми
лиганадами
1У.2.1. Дизайн химерных белков с пришитыми лигандами
Г42.1.1. Дизайн Б2-8НЗ
IV.2.1.2. Дизайн химерных белков с длинным линкром на основе РУГ-8Н3
IV.2.2. Клонирование белков с пришитыми лигандами
Г/.2.3. Кристаллизация белков с пришимыми лигандами
Г/.2.4. Структура БЗ-БНЗ, определенная методом ЯМР
1У.2.5. Кристаллографическая структура С1-8НЗ
1У.2.6. Исследования термодинамики разворачивания структуры химерных
белков с пришитыми лигандами
1У.2.6.1.Спектры флуоресценции и равновесное разворачивание структуры
химерных белков мочевиной
1У.2.6.1.1. Разворачивание Б2-8НЗ мочевиной
ГУ.2.6.1.2. Разворачивание ¥Т-8НЗ и С1-8НЗ мочевиной

1У.2.6.2. Калориметрические исследования белков
1У.2.6.2.1. Исследования Б2-8НЗ
1У.2.6.2.2. Оценка возможных отклонений от «идеализированной» модели
двух состояний для белка Р2-8НЗ
1У.2.6.2.3. Оценка теплоемкости и других параметров для Р2-8НЗ, исходя из
структуры белка
1У.2.6.2.4. Калориметрические исследования химерных белков с длинными линкерами
IV.2.7. Обсуждение результатов структурно-термодлинамических исследований химерных белков с пришитыми лигандами
V. ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

сирибонуклеотидов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP в концентрации 0.2 мМ каждого), олигонуклеотиды-праймеры (по 100 пмоль каждого), 40 нг плазмидной ДНК и 0.2 единицы термостабильной Vent ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили в течение 30 циклов. Условия проведения ПЦР оптимизировались для синтеза каждого ПЦР - продукта. Синтез ДНК осуществлялся при 348 К в течение 30 секунд.
Температуру отжига олигонуклеотидов определяли с помощью программы для IBM PC “Gene Runner” (Hastings Software, США). После окончания ПЦР брали аликвоту из реакционной смеси и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. ПЦР-фрагменты отчищали с использованием фирменного набора QIAquick © PCR Purification Kit (50).
Рестрикцию векторной ДНК (рВАТ4), а также ПЦР - продукта проводили с использованием сайт - специфических эндонуклеаз BamHI и Ncol (Sibenzyme, Россия) в течение 1 часа при температуре 310 К и с рекомендуемой фирмой - производителем количеством фермента. Для проверки полноты рестрикции отбирали пробу из реакционной смеси и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле.
Для получения фрагмента ДНК, содержащего полноценный ген белка WT-CIIA (краткое название C1-SH3), то есть содержащих линкер и лиганд, использовали синтетические олигонуклеотиды. Для получения гена химерного белка C1-SH3 использовали шесть перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов (СО), фосфориллиро-ванных с 5 -конца (рис. III-2.). Синтетические олигонуклеотиды смешивали в эквимолярных количествах и прогревали при 368 К в течение 3 минут и оставляли медленно остывать в термостате на 3 часа. После отжига дополнительно проводили процедуру лигирования. Синтетические олигонуклеотиды были сконструированы таким образом, чтобы после отжига они имели липкие концы, как после обработки рест-риктазами Hindlll и BamHI.