Влияние структуры мРНК на уровень экспрессии генов в Е coli

• Автор: Есипов, Роман Станиславович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Факторы, определяющие эффективность экспрессии генов в

прокариотах на уровне трансляции литературный обзор

1 1 Стадия инициации трансляции является ключевой для

процесса трансляции

1.2. Структура субчастицы рибосомы . i

1.3. Структура м РНК

1.3.1 Первичная структура мРНК, функциональные детерминанты

1.3.1.1. Участок связывания рибосомы

1 3.1.2 Структура участка инициации трансляции
1 3.2. Вторичная структура мРНК
1 3.2 1 Стабильность структуры мРНК
1.3.2.2. Влияние вторичной структуры в районе на эффективность трансляции
1.4. Сопряженная трансляция
Глава 2. Влияние первичной структуры участка инициации трансляции
на уровень экспрессии гена
2.1. Размер I и значение отдельных частей I для эффективной трансляции
2.2. Комплементарное соответствие частей мРНК участкам
рРНК и эффект этого соответствия на уровень экспрессии
Глава 3. Влияние вторичной структуры мРНК на эффективность трансляции и уровень экспресии гена. Дальние комплементарные взаимодействия 1 с кодирующей частью мРНК
Глава 4 Конструирование плазмидных векторов для достижения
высокого уровня экспрессии генов, клонированных в . i
Глава 5 Конструирование эксирессионных плазмиде генами
рекомбинантных белков и достижение высокого выхода биосинтеза этих белков
5.1. Рекомбинантные белки, включающие структуры цепей А и В эктатомина
5.2. Рекомбинантный белок I3 со структурой антигенной детерминанты i i
5.2. Рекомбинантный белок I0X4, содержащий тетрамерную последовательность окситоцина
1 лава 6. Материалы и методы
6.1. Реактивы
6.2. Ферменты
6.3. Материалы
6.4. Препараты
6.5. Олигодсзоксирибонуклсотиды
6.6. Бактериальные штаммы
6.7. Лабораторное оборудование
6.8. Буферы и растворы
6.9. Методы
6.9 I. Гельэлектрофорез
6.9.2. Трансформация клеток и отбор рекомбинантов
6.9.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК
6 9.4. Секвенированне плазмидной ДНК по методу Сенгера
6.9.5. Амплификация ДНК т чИго
6 9 6 Молекулярное клонирование
6.9.7. Экспрессия генов. Анализ белковых продуктов
6.9.8. Иммуноблотинг
6.9.9. Транскрипция т шо
Выводы
Благодарности
Список литературы


i, 3 концевая последовательность рРНК. Взаимосвязь структуры мРНК и эффективности инициации трансляции, определяющей уровень экспрессии генов, давно привлекала внимание исследователей. Были исследованы многочисленные последовательности мРНК, особенно в области инициации трансляции генов имеющих высокий уровень экспрессии. Определен ряд первичных детерминант. Сформулировано общее представление о механизме инициации трансляции Созданы и удачно функционируют многочисленные системы для экспрессии гетерологичных генов в Е. Но часто бывает не вполне понятен молекулярный механизм этих взаимодействий Остается нерешенной проблема выбора какой именно участок на РНК непосредственно взаимодействует с активным элементом в структуре мРНК. Комплементарные взаимодействия этих элементов с соответствующими участками на РНК, определенные путем простого сравнения, часто не могут быть реализованы изза сгерических факторов. Кроме этого остается много вопросов, связанных с дальними взаимодействиями, когда на рибосомсвязывающий сайт оказывают влияние области, далеко расположенные от инициирующего кодона. и субчастиц. Это позволяет с большей достоверностью решать задачу обнаружения новых рибосомсвязывающих сайтов на мРНК и, кроме этого, оптимизировать положения уже известных трансляционных усилителей в 5 нетраслируемой области мРНК. Рассмотрению этих вопросов посвящен литературный обзор в диссертации. Целью настоящей работы было нахождение зависимости уровня экспрессии ряда генов в . I, а также влияние дальних взаимодействий на рнбосомсвязывающий сайт. I для достижения высокого уровня экспрессии генов. В качестве модельных генов нами использовался ген человеческого интерлейкина3, а также ряда гибридных белков на его основе. Глава . Факторы, определяющие эффективность экспрессии генов в прокариотах на уровне трансляции. Процесс декодирования генетической информации экспрессия генов включает две главные стадии транскрипцию генов и трансляцию образующейся мРНК. Трансляция, т. Процесс трансляции зависит от эффективности протекания всех грех его стадий. Первым этапом стадии инициации является образование инициаторного комплекса между областью мРПК, содержащей инициаторный кодон, МсРтРНК и 8субчастицсй рибосомы. В образовании комплекса участвуют факторы инициации РТ, Р2, РЗ 1. На втором этапе к иниииаторному комплексу присоединяется Бсубчастица. Синтез белка это быстрый процесс, скорость которого в большой степени зависит от температуры. У бактерий при С в растущую полипептидную цепь за 1 сек. Конкретная величина скорости элонгации зависит от условий роста клеток. На этом основании возникла гипотеза, что встречаемость кодонов влияет на экспрессию генов 2, 7. Однако в дальнейшем эта гипотеза не получила экспериментального подтверждения . Действительно, элонгация трансляции протекает значительно быстрее инициации и поэтому она вряд ли может лимитировать скорость белкового синтеза и существенно влиять на уровень экспрессии. Лишь в особых случаях использование редких кодонов может оказывать влияние на уровень экспрессии генов . Терминация трансляции осуществляется на одном из трех терминирующих кодонов мРНК, и в этом процессе принимают участие релизингфакторы 1 специфичный для кодонов и и 2 специфичный для кодонов и , Релизингфактор 3 ускоряет диссоциацию факторов I и 2 от рибосомы На эффективность терминации трансляции влияет и структура Сконцевой последовательности образующегося полипептида . Среди трех стадий процесса трансляции стадия инициации, как лимитирующая скорость, является определяющей эффективность процесса. Структура субчастицы рибосомы . Рибосома это крупный самоорганизованный рибонуклеопротеидный комплекс со сложной асимметричной структурой, состоящий из двух субчастиц. У прокариотов целая рибосома состоит из малой и большой субчастиц. субчастица состоит из рРНК и различного белка, субчастица состоит из рРНК, 5 рРНК и различных белков .