Ras-dva - новое семейство малых ГТФаз. Роль малой ГТФазы Ras-dva в раннем развитии шпорцевой лягушки

• Автор: Терёшина, Мария Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

1. Обзор литературных данных
1.1 Нейральная индукция и регионализация эмбриональной эктодермы.
l'.ltl. Дифференцировка нервной пластинки
1.1.2. Дифференцировка пан-плакодной области эктодермы
1.1.3 Дифференцировка области нервного гребня
1.2. Гомеодоменный транскрипционный фактор Anf - регулятор раннего развития переднего мозга позвоночных
1.3 Генетические мишени гомеодоменного транскрипционного фактора Xanfl.
1.4 ГТФ-связывающие белки
1.5 Суперсемейство малых ГТФаз
1.5.1 Основные характеристики и свойства малых ГТФаз
1.5.1.1 Цикл активации/инактивации малых ГТФаз
1.5.1.2 Строение и функция каталитического G-домена
1.5.1.2.1 Связывание ГТФ
1.5.1.2.2 Гидролиз ГТФ и вспомогательные GAP белки
1.5.1.3 Внутриклеточная локализация малых ГТФаз
1.5.2 Семейства малых ГТФаз и их роль в эмбриогенезе
1.5.2.1 Ras семейство малых ГТФаз
1.5.2.2 Rho семейство малых ГТФаз
1.5.2.3 Rab семейство малых ГТФаз
1.5.2.4 ArP Sari семейство малых ГТФаз
1.5.2.5 Ran семейство малых ГТФаз
1.5.2.6 RGK семейство малых ГТФаз
1.5.2.7 RJL семейство малых ГТФаз
1.5.2.8 Gie семейство малых ГТФаз
1.6 Заключение
2. Результаты и их обсуждение
2.1 Выяснение систематического положения новой малой ГТФазы 47 Иав-йуа в суперсемействе малых ГТФаз
2.1.1. Поиск гомологов белка Каэ-буа шпорцевой лягушки у разных организмов и анализ их аминокислотных последовательностей.
2.1>.2. Филогенетическое древо суперсемейства малых ГТФаз с 51 новыми белками Каэ-буа
2.1.3. Сравнительный анализ консенсусных аминокислотных последовательностей О-домена белков Каэ-буа и других малых ГТФаз.
2.2. Изучение функциональной роли малой ГТФазы Иаз-буа в процессах раннего эмбрионального развития на модели зародышей шпорцевой лягушки Хепорт 1ае1ъ.
2.2.1. Изучение внутриклеточной локализации белка Яаз-буа
2.2.2. Динамика экспрессии гена Лаз-Луа в эмбриогенезе 59 шпорцевой лягушки.
2.2.3. Регуляция начальных этапов экспрессии гена 2?ях-о?уа
2.2.4. Морфологические аномалии развития, возникающие при нарушении функционирования гена Лая-Луа на ранних этапах развития, и подтверждение их специфичности.
2.2.5. Влияние ингибирования работы гена или белка Каэ-буа на 74 экспрессию специфичных генов-маркеров, регуляторов раннего развития зародышей шпорцевой лягушки.
2.2.6. Поиск специфического сигнального каскада, в котором 80 может принимать участие малая ГТФаза Каэ-буа на ранних этапах развития зародышей шпорцевой лягушки.
3. Выводы
4. Материалы и методы
4.1. Материалы
4.1.1. Реактивы
4.1.2. Ферменты
4.1.3. Лабораторное оборудование
4.1.4. Лабораторные животные
4.1.5. Буферы и растворы
4.1.6. Миробиологические среды
4.1.7. Предоставленные плазмидные конструкции
4.1.8. Предоставленные dig-зонды
4.2. Методы исследования
4.2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной 89 реакции (ПЦР).
4.2.2. Изготовление ДНК конструкций
4.2.2.1. Клонирование гена шпорцевой лягушки FgfSa
4.2.2.2. ПЦР-мутагенез. Создание генов, кодирующих мутантные варианты белков Ras-dva и K-Ras.
4.2.3. Транскрипция in vitro
4.2.4. Получение зародышей шпорцевой лягушки. 92 Микроинъекции.
4.2.5. Блокирование эндогенной мРНК Ras-dva при помощи микроинъекций синтетических анти-смысловых морфолино олигонуклеотидов или олигонуклеотидов на основе гидроксипролина.
4.2.5.1. Морфолино олигонуклеотиды
4.2.5.2 Аналоги пептид-нуклеиновых кислот (PNA): отрицательно заряженные PNA-подобные ДНК миметики.
4.2.6. Фиксация зародышей шпорцевой лягушки
4.2.7. Гибридизация In situ
4.2.8. Синтез dig-меченой анти-смысловой РНК для 99 приготовления гибридизационой пробы.
4.2.9. Парафиновые срезы фиксированных препаратов
4.2.10 Экстракция тотальной РНК из эксплантатов анимальной эктодермы зародышей шпорцевой лягушки. Обратная транскрипция и полимерразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).
4.2.11. Трансфекция клеток линии мышиных фибробластов NIH-3T3

Рис.9 Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белков Яаз-буа (в программе СШвТАЕ W (1.83))