Клонирование, экспрессия и сравнительный анализ пероксиредоксинов 6 различного происхождения

• Автор: Шарапов, Марс Галиевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.АФ К
1.1 .Источники возникновения АФК
I.2. Последствия действия АФК
2. Антиоксиданты
2.1. Супероксиддисмутазы (SOD)
2.2. Каталаза
2.3. Глутатионпероксидазы (GPx)
2.4. Пероксиредоксины (Ргх)
2.4.1. Открытие пероксиредоксинов. Эволюция Ргх и их классификация
2.4.2. Каталитический цикл Ргх
2.4.3. Структура Ргх
2.4.4. Регуляции активности Ргх
2.4.5. Ргх из различных организмов
Ргх прокариот
Ргх архебактерий
Ргх эукариот
2.4.6. Ргх человека
Prxl
Ргх2
РгхЗ
Ргх4
Ргх5
Ргхб
2.4.7.Возможное применение Ргх в медицине
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы
2. Методы
2.1. Выделение РНК
2.2. Определение чистоты и концентрации нуклеиновых кислот
2.3. ОТ ПЦР

2.4. Мутагенез Ргхб человека
2.5. Электрофорез ДНК
2.6. Сравнение уровня экспрессии ргхб X. laevis на разных стадиях развития
2.7. Клонирование и экспрессия генов ргхб
2.8. Выделение и очистка белков Ргхб
2.9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.10. Иммунно блоттинг
2.11. Определение активности SOD слитой конструкции Mn-SOD-Ргхб
2.12. Определение антиоксидантной активности
2.13. Определение пероксидазной активности
2.14. Определение констант Михаэлиса
2.15. Определение оптимума pH и температуры
2.16. Определение фосфолипазной активности
2.17. Определение термостабильности
2.18. Исследование структуры Ргхб
2.19 .In silico методы
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Получение генов ргхб
2. Экспрессия генов ргхб
3. Получение ферментов Ргхб
4. Антиоксидантная активность Ргхб
5. Пероксидазная активность Ргхб
6. Субстратная специфичность Ргхб
7. Оптимум pH и температуры пероксидазной реакции
8. Фосфолипазная активность Ргхб
9. Термостабильность Ргхб
10. Структура Ргхб
11. Перспективы применения Ргхб в медицине
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АФК - активные формы кислорода
SOD - супероксид дисмутаза
GPx - глутатионпероксидаза
nGST - глутатион S-трансфераза тс
GSH - восстановленный глутатион
GSSG - окисленный глутатион
Prxl-б - пероксиредоксин
ГПТБ - гидропероксид трет-бутила
PBS - фосфатный буфер
PMSF - фенилметилсульфонил флуорид
IPTG - изопропил р-тиогалактозид
SDS - додецилсульфат натрия
PSA - персульфат аммония
TEMED - тетраметилэтилендиамин
iPLA2 - Са2+ независимая активность фосфолипазы А2
DPPC - дипальмитоил фосфотидилхолин
DPPE - дипальмитоил фосфотидилэтаноламин
LysoPC - лизофосфотидилхолин
Рис.7. Антиоксидантная функция Ргх4 в кровяном русле и его взаимодействия с поверхностью клеток эндотелия.
Хотя в большинстве тканей Ргх4 встречается как процессированная - секретируемая форма, существенные фракции непроцессированной формы остаются в семенниках. Морфологические исследования семенников с помощью иммунно-электронной микроскопии показали, что значительная фракция Ргх4 является высокомолекулярной, связывающейся с мембраной [Sasagawa І. еі аі. 2001]. Секретированная форма Ргх4 обладает пероксидазной активностью, тогда как его предшественник неактивен. Таким образом, становится ясно, что мембрано-связывающая форма Ргх4 выполняет другую функцию, не связанную с пероксидазной активностью, и может играть важную роль в сперматогенезе. Переход из секретируемой формы Ргх4 к мембрано-связанной ассоциирован с фазами сперматогенеза, в ходе которого формируются уникальные многослойные везикулы (рис.8).