Синтез и изучение фрагментов РНК-полимеразы вируса гриппа A

• Автор: Матусевич, Олег Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Пептиды как потенциальные лекарственные средства

2.1.1 Преимущества и недостатки терапевтических пептидов

2.1.2 Химические стратегии улучшения биологической активности, специфичности и стабильности пептидов

2.2 Синтез пептидов

2.3 Вирусные белки - потенциальные лекарственные мишени

2.3.1 Гемагглютинин (НА)

2.3.2 Нейраминидаза (ИА)

2.3.3 Протонный канал М

2.3.4 Нуклеопротеин (ИР)
2.3.5 Белки М1 и М
2.3.6 Неструктурный белок 1 (N81)
2.3.7 Белок ядерного экспорта (Ъ1ЕР или N82)
2.3.8 РНК-полимераза
2.3.8.1 Структурная организация и функции
2.3.8.2 Взаимодействие субъединиц РВ1 и РА
2.3.8.3 Перспективы разработки противовирусных средств
2.3.8.4 Взаимодействие субъединиц РВ1 и РВ
2.3.9 Белки РВ1-Б2 и РВ1 -БЗ (N40)
2.3.10 Белки РА-Х, РА-И155 и РА-И
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1 Синтез пептидов
3.1.1 Последовательное наращивание пептидной цепи
3.1.2 Конвергентный синтез
3.2 Противовирусная активность пептидов
4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1. Материалы и методы исследования

4.2 Синтез пептидов
5. ВЫВОДЫ
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
8.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВВЕДЕНИЕ
Среди респираторных вирусных инфекций вирус гриппа занимает особое место. По данным ВОЗ, ежегодная смертность от гриппа в мире составляет 250-500 тысяч человек [1]. Наиболее опасным из трех типов этого вируса является вирус гриппа А: согласно [2], все пандемии гриппа с начала XX века по настоящее время были вызваны именно этим вирусом.
Ввиду непредсказуемости молекулярно-генетических и иммунологических характеристик новых эпидемических и пандемических штаммов вируса гриппа А, защита, обеспечиваемая вакцинацией, не является достаточно надежной, и химиотерапия сохраняет свою актуальность [3, 4]. Главной проблемой химиотерапии является появление штаммов, устойчивых к действию препаратов. Так, известны штаммы, резистентные к осельтамивиру, одному из основных противогриппозных препаратов. Поэтому необходим поиск новых соединений, действующих на различных стадиях жизненного цикла вируса гриппа [3, 4, 5].
Перспективной мишенью для химиотерапии гриппа являются консервативные белки: использование таких мишеней может позволить в значительной степени избежать проблемы формирования резистентности к препаратам. Одной из таких мишеней, не задействованной в современных препаратах, использующихся в клинической практике, в случае вируса гриппа А является фермент РНК - полимераза, катализирующий синтез вирусной РНК.
Цель работы: поиск пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ1, подавляющих репликацию вируса гриппа А. Для достижения поставленной цели в работе были решены следующие задачи:
1. выбор пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ1;
2. разработка синтеза целевых соединений;
3. тестирование синтезированных пептидов;
4. модификация наиболее активных соединений с целью увеличения их биологической активности.

Вероятно, данное соединение связывается с минорным т7-карманом кэп-связывающего сайта РВ2.
В работе [160] было показано, что соединение Т-705 обладает высокой активностью в отношении вируса гриппа, в том числе в отношении штаммов, устойчивых к ремантадину и оселтамивиру:

Роль белка РА в полимеразном гетеротримере выяснена лишь частично. Есть сообщения о том, что он необходим для репликации и транскрипции РНК, а также для эндонуклеазного отщепления РНК-кэп-праймера [161, 162]. Проведённый авторами [163] скрининг 33-х макроциклицеских соединений позволил идентифицировать марчантин Е в качестве ингибитора эндонуклеазной активности РА. Есть данные о том, что субъединица РА также индуцирует протеолиз вирусных и хозяйских белков и, возможно, участвует в сборке вируса [164, 165].
Архитектура полимеразного комплекса интенсивно исследовалась с
целью определения минимального набора компонентов, необходимого для
вирусной транскрипции или репликации. Есть сообщения о том, что белок РВ
не требуется для репликации и одна лишь субъединица РВ1 способна
синтезировать РБК [166]. Было показано, что димер РВ1-РА синтезирует de
novo транскрипт длиной в 53 нуклеотида с использованием вРНК-промотора,
но не способен эффективно синтезировать РЕПС с кРНК-промотора [167].
Однако другие исследователи [168], используя рекомбинантный белковый
комплекс, продемонстрировали, что только гетеротример способен
синтезировать динуклеотиды pppApG, а димеры РВ1-РВ2 или РВ1-РА не
способны осуществлять этот процесс, что согласуется с результатами
предыдущих исследований, в одном из которых показана необходимость белка
РВ2 для репликации [169, 170]. Точечная мутация в положении 510 белка РА,
приводящая к нарушению синтеза вирусной мРНК, указывает на то, что
субъединица РА также необходима для транскрипции [171]. Таким образом,