Синтез адресных липоконъюгатов для изучения направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени

• Автор: Шмендель, Елена Васильевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Т. Литературный обзор

1.1. Направленная доставка НК в эукариотические клетки

1.1.1. Рецептор-опосредованный эндоцитоз

1.2. Типы адресных лигандов и их использование для доставки различных терапевтических агентов

1.2.1. Использование фолиевой кислоты в качестве адресного лиганда

1.2.1.1. Адресная доставка терапевтических НК с помощью фолатсодержащих транспортных систем

1.2.1.2. Адресная доставка противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки

1.2.1.3. Адресная доставка терапевтических молекул для лечения воспалительных заболеваний
1.2.2. Использование маннозы в качестве адресного лиганда
1.2.2.1. Дендритные клетки
1.2.2.2. ДНК-вакцинация
1.2.2.3. Рецептор маннозы
1.2.3 Галактоза и ее производные
1.2.3.1. Доставка нуклеиновых кислот с помощью углеводсодержащих липосом
1.2.3.2. Использование неогалакгоконъюгатов для лечения заболеваний печени
1.3. Заключение
2. Обсуждение результатов
2.1. Синтез липоконъюгатов с адресными лигандами различных типов
2.1.1. Присоединение спейсерной группы к 1,2-ди-(9-тетрадецил-гас-глицерину
2.1.2. Связывание адресных лигандов с функционализированными диглицеридами
2.1.2.1. Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов
2.1.2.2. Синтез гликоконъюгатов

2.2. Создание и исследование свойств адресных липосомальных систем доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени
2.2.1. Определение цитотоксичности адресных катионных липосом
2.2.2. Изучение трансфицирующей активности адресных катионных липосом
2.2.2.1. Изучение влияния соотношения компонентов липоплексов на адресную доставку НК в эукариотические клетки
2.2.2.2. Скрининг адресных липосом с фолатсодержащими липоконъюгатами по трансфицирующей активности
2.2.2.3. Оценка способности адресных липосом направленно доставлять НК в клетки, экспрессирующие фолатные рецепторы
2.2.2.4. Доставка плазмидной ДНК в дендритные клетки с помощью
маннозилсодержащих адресных липосом
3. Экспериментальная часть
3.1. Основные методы
3.2. Синтез липоконъюгатов с адресными лигандами различных типов
3.2.1. Присоединение спейсерной группы к 1,2-ди-0-тстрадецил-7-де-глицерину
3.2.2. Присоединение адресных лигандов к функционализированным диглицеридам
3.2.2.1. Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов
3.2.2.2. Синтез гликоконъюгатов
3.3. Создание и исследование свойств адресных липосомальных систем доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени
3.3.1. Приготовление адресных катионных липосом
3.3.2. Олигонуклеотиды и плазмидная ДНК
3.3.3. Приготовление комплексов КЛ/НК
3.3.4. Определение размера и поверхностного потенциала липосом и их комплексов с нуклеиновыми кислотами
3.3.5. Электрофорез
3.3.5.1. Электрофорез вПААГ в нативных условиях
3.3.5.2. Электрофорез в агарозном геле
3.3.6. Клеточные культуры
3.3.7. Исследование цитотоксичности с помощью МТТ-теста
3.3.8. Трансфекция клеток комплексами, сформированными РГГС-ООЫ и КЛ
3.3.9. Трансфекция клеток комплексами, сформированными рРХЗРР-С2 и КЛ
3.3.10. Проточная цитометрия
3.3.11. Доставка нуклеиновых кислот в дендритные клетки
3.3.11.1 СБ11 с+ предшественники ДК
3.3.11.2 Незрелые ДК
3.3.11.3. Трансфекция СБПсТ предшественников и незрелых ДК
ВЫВОДЫ
Список литературы

Для терапии карциномы печени была получена липосомальная форма противоопухолевого агента доксорубицина (7). В состав липосом входил гликоконъюгат 25, синтезированный на основе 1.2-диолеоил-.Уи-глицсро-3-фосфоэтаноламина.

Наличие лактозы на поверхности липосом приводило к увеличению накопления доксорубицина в опухоли и подавлению ее роста по сравнению с липосомами, не содержащими адресного лиганда [103].
1.3. Заключение
На сегодняшний день разработаны различные типы наноразмерных липосомальных систем доставки НК и других лекарственных средств. Для обеспечения направленного терапевтического воздействия в состав липосом необходимо вводить липоконъюгат, содержащий в своей структуре адресный лиганд. В случае противоопухолевой терапии в качестве адресного лиганда используется фолиевая кислота, для доставки ДНК-вакцин в состав катионных липосом вводятся липоконъюгаты с остатком П-маннозы, а при лечении заболеваний печени соединения с остатком В-галактозы.
Однако при решении проблемы адресной доставки НК необходимо также учитывать влияние физико-химических характеристик липосом и, формируемых ими, комплексов с НК. Наиболее важными физико-химическими параметрами являются размер и поверхностный потенциал комплексов, которые зависят от используемого соотношения