Структурно-функциональная топография рибосом человека по данным аффинной модификации реакционноспособными производными олигорибонуклеотидов

• Автор: Грайфер, Дмитрий Маратович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 279 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Принятые сокращения

Введение

Глава 1. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ РИБОСОМЫ

И ЕЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЦЕНТРОВ {обзор литературы)

1.1. Общая характеристика рибосомных субчастиц эукариот

1.1.1. Особенности морфологии 40S и 60S субчастиц

1.1.2. Изменчивость структуры рибосом эукариот

1.2. Компоненты эукариотической рибосомы

1.2.1.1. Вторичная структура рРНК
1.2.1.2. Номенклатура элементов вторичной структуры рРНК
1.2.1.3. Роль рРНК в структурной организации и функционировании рибосом
1.2.2. Рибосомные белки
1.2.2.1. Номенклатура и особенности рибосомных белков
1.2.2.2. Г омология между рибосомными белками эукариот, эубактерий
и архей
1.2.2.3. Посттрансляционные модификации
1.2.2.4. Роль рибосомных белков в структурной организации и функционировании рибосомы эукариот
1.2.3. Ионы Mg2+ и полиамины
1.3. Укладка белков и рРНК в рибосомных субчастицах эукариот
1.3.1 Укладка рРНК
1.3.1.1. Методология химического, энзиматического и олигонуклеотидного пробинга
1.3.1.2. Пробинг вторичной и третичной структуры рРНК
1.3.2. Расположение белков и рРНК на рибосоме
1.3.2.1. Данные, полученные с помощью сшивок
1.3.2.2. Расположение белков на поверхности субчастиц по данным иммуноэлектронной микроскопии
1.3.2.3. Расположение рРНК и белков в рибосомных субчастицах
по данным крио-ЭМ
1.4. Строение функциональных центров эукариотической рибосомы
1.4.1. Участки рРНК, вовлеченные в функционирование рибосомы
1.4.1.1. Участки, вовлеченные в ассоциацию субчастиц
1.4.1.2. Участки 188 рРНК, вовлеченные в связывание е!РЗ
на 408 субчастице
1.4.1.3. Участки рРНК, вовлеченные в связывание еЕР2 на 808 рибосоме
и «ОТРаза-активируюгций центр»
1.4.1.4. Участки рРНК, вовлеченные в связывание мРНК, пептидил-тРНК и белков, ассоциированных с полисомами
1.4.1.5. Фрагмент 1рРНК в районе декодирующего центра
1.4.1.6. Фрагмент 5.8Б рРНК, вовлеченный в процесс транслокации
1.4.2. Рибосомные белки, влияющие на функционирование рибосомы
1.4.3. Строение функциональных центров рибосомы эукариот по данным
крио-ЭМ
1.4.3.1. Контактные поверхности субчастиц
1.4.3.2. тРНК-связывающие центры
1.4.3.3. мРНК-связывающий центр
1.4.3.4. Участок связывания еЕБ2
1.4.3.5. Участок связывания еЕЬЗ
1.4.3.6. Выход из полипептидного туннеля и участок связывания БКР
1.4.3.7. Участок связывания большой субчастицы с мембраной эндоплазматического ретикулума
Заключение
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
2.2. Выделение рибосомных 408 и 608 субчастиц из плаценты человека
2.3. Введение радиоактивной метки на З’-конец олигорибонуклеотидов и
их производных
2.3.1. Введение метки на З’-конец олигоуридилатов
2.4. Получение меченых 2’,3’-0-бензилиденовых производных
Олигорибонуклеотидов
2.5. Введение радиоактивной метки на 5’-конец олигонуклеотидов
или их производных
2.6. Получение производных олигорибонуклеотидов, содержащих
реакционноспособную группу на 5’-фосфате

2.6.1. Введение алкилирующей группы по 5’-фосфату
2.6.2. Введение перфторфенилазидогруппы по 5’-фосфату
2.7. Синтез и анализ фотоактивируемых производных
олигорибонуклеотидов, несущих перфторфенилазидогруппу на атоме
N7 остатка гуанина
2.8. Гидролиз олигорибонуклеотидов и их производных РНКазой Т1
2.9. Ацетилирование РЬе-тРНКр'1е
2.10. Введение метки j2P на 5’-конец тРНК
2.11. Получение комплексов 80S рибосом с аналогами мРНК -производными олигорибонуклеотидов - в присутствии родственных
тРНК
2.12. Получение синтетических аналогов мРНК, несущих остатки 4-
тиоуридина
2.13. Получение комплексов 80S рибосом с синтетическими аналогами
мРНК, несущими остатки 4-тиоуридина
2.14. Определение степени связывания меченых лигандов с 80S
рибосомами
2.15. Аффинная модификация 80S рибосом производными олигорибонуклеотидов с алкилирующей группой на 3’- или 5’-конце
2.16. Аффинная модификация 80S рибосом перфторфенилазидо-производными олигорибонуклеотидов и синтетическими аналогами
мРНК, несущими остатки 4-тиоуридина
2.17. Разделение модифицированных 80S рибосом на субчастицы
2.18. Разделение модифицированных субчастиц на РНК и белки в
градиенте плотности сахарозы
2.19. Разделение модифицированных субчастиц на РНК и белки гель-электрофорезом в присутствии SDS
2.20. Выделение суммарной РНК из рибосом
2.21. Анализ модификации 18S рРНК гель-электрофорезом
2.22. Установление районов 18S рРНК, содержащих участки сшивки с
меченым аналогом мРНК
2.22.1. Определение района 18S рРНК с помощью блот-гибридизации
2.22.2. Определение района 18S рРНК с помощью гидролиза РНКазой Н
2.23. Определение модифицированных нуклеотидов в 18S рРНК с помощью

-, Г? , SSfc
3IF4E
Sc|>160[>

Рис. 4. Положение рецептора активированной С-киназы (receptor for activated C-kinase, RACK1) на 80S рибосоме и его предполагаемые взаимодействия с сигнальными молекулами (Nissen et al., 2004). (А) Крио-ЭМ-карта 80S рибосом S. cerevisiae, на которой указано положение RACK1 (отмечен красным цветом) на малой субчастице (окрашена в желтый цвет). Стрелкой указано место выхода мРНК. (B-D) Схематическое представление RACK1 (отмечен красным цветом), связанного с регуляторными молекулами,
расположенными на рибосоме вблизи мРНК (окрашена в розовый цвет). (В) Протеинкиназа С (Protein kinase С, РКС отмечена светло-голубым), связанная с рибосомой вблизи белков, ассоциированных с мРНК, таких как фактор инициации eIF4E (отмечен серым). (С) RACK1. взаимодействующий с белком, специфично связывающимся с мРНК, например, белком Scpl60p (отмечен серым). (D) Рибосомы, привлеченные к участкам присоединения к мембране через взаимодействие между интегрином-ß . (отмечен темно-коричневым цветом) и RACK1. Показано, как трансляция может происходить в то время, когда RACK1 взаимодействует с рецептором (мРНК отмечена розовым, тРНК- зеленым, а фактор элонгации 2 - оранжевым цветом).
int*grin-jj
полиаминов. Наличие спермина или спермидина значительно (в 2-3 раза) снижает эту величину и одновременно в 2-3 раза увеличивает эффективность трансляции (Ogasawara et al., 2000; Ferreras et al., 2004). Это указывает на то, что полиамины не только частично “замещают” Mg2+, но и способствуют формированию наиболее оптимальной для функционирования структуры рибосом. Влияние полиаминов и Mg2+ на рибосомы прокариот (см., например, Bartetzko and Nierhaus, 1988) в целом сходно с их влиянием на рибосомы эукариот.