Окислительное расщепление нуклеиновых кислот конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами

• Автор: Воробьев, Павел Евгеньевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 104 с. : ил.

Список сокращений

1. Введение
2. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами (обзор литературы)

2.1. Общая характеристика блеомицинов

2.2. Структура блеомицинов

2.3. Активация комплексов блеомицина с ионами железа

2.4. Связывание блеомицина с нуклеиновыми кислотами

2.5. Специфичность расщепления нуклеиновых кислот блеомицином

2.6. Эффективность расщепления РНК блеомицином

2.6.1. Сравнение эффективности расщепления различных РНК

2.6.2. Зависимость эффективности расщепления от концентрации ионов магния

2.7. Продукты расщепления нуклеиновых кислот блеомицином
2.8. Свойства конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами
2.8.1. Синтез конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами
2.8.2. Стабилизация комплементарных комплексов конъюгагмишень остатком блеомицина
2.8.3. Сайт-специфическое расщепление одноцепочечных ДНК
2.8.4. Каталитическое расщепление одноцепочечной ДНК олигонуклеотидным конъюгатом блеомицина
2.8.5. Расщепление двуцепочечной ДНК в составе триплекса
3. Расщепление нуклеиновых кислот блеомициновыми производными олигонуклеотидов
(Результаты и обсуждение)
3.1. Синтез блеомициновых производных олигонуклеотидов
3.1.1. Синтез стандартных конъюгатов
3.1.2. Синтез линкерсодержащих конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами
3.2. Расщепление одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами
3.2.1. Расщепление одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с протяженной олигонукпеотидной частью
3.2.2. Расщепление ДРІК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в присутствии олигонуклеотидных эффекторов
3.2.2.1. Факторы, определяющие эффективность расщепления одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в составе тандемных комплексов
3.2.3. Влияние гидрофобных и гетероциклических группировок в составе конъюгата и эффекторов на эффективность расщепления одноцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в составе тандемных комплексов
3.3. Субстратные свойства гибридных дуплексов, образованных с участием тандемов производных коротких олигонуклеотидов по отношению к рибонуклеазе Н E. coli
3.3.1. Гидролиз РНК рибонуклеазой Н E. coli в составе гибридного дуплекса, образованного с участием немодифицированпого тандема коротких олигодезоксирибонуклеотидов
3.3.2. Субстратные свойства тандемных гибридных дуплексов, содержащих конъюгаты блеомицина с короткими олигонуклеотидами, по отношению к рибонуклеазе Н E. coli
3.4. Расщепление РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами
3.5. Расщепление двуцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с триплекс-формирующими олигонуклеотидами (ТФО)
3.6. Заключение
4. Экспериментальная часть
4.1. Исходные материалы
4.2. Основные методы работы
4.2.1. Хроматографические методы
4.2.2. Электрофорез
4.2.3. Спектрофотометрия
4.3. Методики эксперимента
5. Выводы
6. Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (ШРАС) и международного союза биохимиков (ШВ), а также следующие обозначения:
РИО реакционноспособные производные олигонуклеотидов
РЬ3Р трифенилфосфин
(РуЬЪ 2,2’-дипиридилдисульфид
Трис трис(оксимстил)аминометан
НЕРЕБ М-2-гидроксиэтилпиперазин->Г-2-этансульфоновая кислота
ОМАРО 4-М,М-диметиламинопиридин-1 -оксид
им во диметилсульфоксид
ВР бромфеноловый синий
ХС ксиленцианол РР
В1т блеомицины групп А и Б
НК нуклеиновая кислота
ТФО триплекс-формирующие олигонуклеотиды
Тпл температура плавления НК-дуплекса
ПААГ полиакриламидный гель
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
А оптическая плотность
УФ ультрафиолетовый
Таким образом, наблюдаются две противоположных зависимости эффективности расщепления от температуры реакции. Эффективность длинных конъюгатов (В1тр^, ШтрМп) увеличивается с повышением температуры, тогда как наиболее эффективный конъюгат В1тр^ с ростом температуры частично теряет свою активность.
Возможной причиной ограничения активности конъюгатов могло бы быть расщепление олигонуклеотидной части конъюгата его собственным остатком блеомицина. Было исследовано расщепление мишени 02 0 32Р-мечеными конъюгатами в присутствие эффекторов. Выяснилось, что олигонуклеотидная часть конъюгата В1тр1Ч| в процессе реакции расщепляется незначительно (<10%). Конъюгаты В1тр^ и В1тр1Ч12 расщепляются на 18-21%. Таким образом, саморасщепление конъюгатов не может существенно снижать их эффективность. Кроме того, предельная степень саморасщепления конъюгатов не зависит от температуры реакции, и практически одинакова при 25 и 45 °С. Очевидно, что саморасщепление конъюгатов не может объяснить различий в зависимости эффективности конъюгатов от температуры.
Была исследована стабильность комплементарных комплексов (выделенные участки в комплексах 12-15 на рис. 16), образуемых конъюгатами с ДНК в присутствии эффекторов. Конъюгат В1тр]4 в присутствии эффектора Р1шр^(1)Р1т образует с мишенью Б20 комплементарный комплекс с температурой плавления 31 °С (комплекс 12). В присутствии дополнительно эффектора Р1н1р^(2)Р1т температура плавления этого комплекса возрастает до 45 °С (комплекс 13). Следует отметить, что температура плавления комплекса конъюгат-мишень определялась по разнице дифференциальных кривых термической денатурации комплексов 12, 13, 14 и 15 и кривых термической денатурации комплексов, образованных эффекторами с ДНК в отсутствие конъюгата. Полученная кривая во всех случаях имеет выраженный максимум, по положению которого и оценивали температуру плавления комплекса конъюгат-ДНК. Правильность такой оценки в случае комплекса 13 была дополнительно подтверждена разностной термической денатурацией. В этом случае кривая термической денатурации комплекса конъюгат-ДНК в присутствии эффекторов регистрировалась относительно комплекса эффекторов с ДНК, помещенного в кювету сравнения. Полученная дифференциальная кривая термической денатурации (жирная линия) практически совпадает с расчетной (тонкая линия) (Рис. 19).