ДНК/РНК-гидролизующий фрагмент фактора дифференцировки 8,2 кДа клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека : Идентификация и свойства

• Автор: Драницына, Светлана Михайловна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ; ИХ РОЛЬ В АПОПТОЗЕ.

1. Проблема белково-нуклеинового узнавания

1.1. Сайт-специфические ферменты

1.2. Сайт-неспецифические белки

2. Исследования молекулярного механизма функционирования нуклеаз

3. Апоптоз - генетически контролируемая форма клеточной гибели

4. Роль нуклеаз в апоптозе

5. Активные формы кислорода (АФК) в апоптозе

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Идентификация фрагмента НЬБЕ, потенциально обладающего ДНК/РНК-гидролизующей активностью
2. Клонирование кДНК НЬНР-8 в хорошо экспрессирующий вектор приводит к подавлению его экспрессии
3. Определение нуклеотидсвязывающей способности синтезированных пептидов
4. Исследование механизма нуклеолитической реакции
5. Влияние НЫ)Е-8 на клетки НЬ
6. Использование поликлональных антител против НЬОР и НЫ)Е-8 в качестве иммуногистохимических маркеров ранних неопластических процессов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы
2. Методы
2.1. Приготовление агарозного геля
2.2. Выделение плазмидной ДНК E. coli методом щелочного лизиса
2.3. Рестрикция и картирование фрагментов ДНК
2.4. Перенос ДНК на мембрану по методу Саузерна

2.5. Иммобилизация ДНК из E. coli на нитроцеллюлозных фильтрах
2.6. Ник-трансляция ДНК
2.7. Радиоактивное мечение олигодезоксирибонуклеотидных зондов
2.8. Блот-гибридизация по Саузерну. Гибридизация in situ бактериальных колоний и фаговых бляшек
2.9. Выделение ДНК из агарозы
2.10.Лигировани е
2.11 .Получение компетентных клеток E. coli
2.12.Трансформация компетентных клеток E. coli
2.13.Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.14.0тбор рекомбинантных клонов с помощью ПЦР
2.15.Определение нуклеотидных последовательностей по методу Сенгера
2.16.Продукция гибридного белка в клетках E. coli В834
2.17.Лизис клеток-продуцентов
2.18.Анализ продуктов экспрессии
2.19.0пределение А-концевых аминокислотных последовательностей
2.20.Получение поликлональных антител
2.21.Культивирование клеток HL
2.22.0пределение дифференцирующей активности
2.23.Синтез и очистка пептидов
2.24.0пределение нуклеазной активности
2.25.Частичная апуринизация ДНК плазмиды pSp65
2.26.Спектр поглощения HLDF
2.27.Хроматографический анализ взаимодействия синтетических пептидов с олигонуклеотидами
2.28. Введение флуоресцентных меток
2.29.N- Концевой аминокислотный анализ
2.30.Анализ деградации яДНК клеток HL-60 под действием различных индукторов
2.31.МТТ-тес т
2.32.0ценка количества клеток, вступивших в апоптоз с помощью проточного
цитофлуориметра
2.33. Прижизненное окрашивание клеток HL
2.34.Иммуногистохимическое окрашивание клеток HL
2.35.Трансфекция HLDF в клетки HL-60 с помощью унифектина
2.36.Имуногистохимический анализ среза ткани предстательной железы
человека
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

факторов. Группа протеаз, участвующих в апоптозе, была обнаружена при изучении модели цитолиза, индуцированного Т лимфоцитами. Цитотоксические лимфоциты или природные киллеры (НК) вызывают гибель клеток - мишеней, секретируя в них плотные цитоплазматические гранулы, содержащие различные сериновые протеазы - гранзимы [83]. Гранзим А обладает трипсиноподобной активностью, расщепляя связи Гуь-Х и Аг§-Х, тогда как гранзим В и его аналог из лимфоцитов крыс, фрагментин-2, действуют как уникальные сериновые протеазы, расщепляя связи А,$р-Х. Порообразующие белки перфорины, другие компоненты плотных гранул, могут при определенных условиях индуцировать лизис клеток-мишений, но не межнуклеосомную фрагментацию ДНК. Предполагается, что гранзим В проникает в клетки через поры, образуемые перфоринами.
В большинстве клеток, подвергшихся апоптозу под действием различных индукторов, обнаружено увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ [84, 85]. Поэтому были проведены исследования участия Са2+- зависимых протеаз -кальпаинов в гибели клеток. Кальпаины образуют семейство цистеиновых протеаз, представленных двумя широкораспространенными изоформами кальпаин I и кальпаин II или ц-кальпаин и ш-кальпаин, соответственно, и несколькими тканеспецифическими протеазами. р-Кальпаин и ш-кальпаин представляют собой гетеродимеры, состоящие из большой и малой субъединиц. Потенциальными субстратами кальпаинов являются белки цитоскелета и ядерного матрикса, рецепторы, протеинкиназа С, фосфатазы и факторы транскрипции. При расщеплении кальпаином протеинкиназы С образуется фрагмент, активность которого не зависит от кофакторов. Ингибиторы кальпаина предотвращают апоптоз.