Узнавание ДНК эукариотическими ДНК-топоизомеразами I

• Автор: Бугреев, Дмитрий Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 173 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Топология геномной ДНК: влияние на клеточные процессы и се регуляция ДНК-топоизомеразами
1.2. Классификация и некоторые свойства ферментов
1.3. Некоторые аспекты механизма действия топоизомераз
1.4. ДНК гопоизомеразы подкласса IA
1.4.1. ДНК-топоизомераза I E. coli
1.4.1.2. Рентгеноструктурный анализ фермента
1.4.2. ДНК-топоизомераза III E. coli
1.4.3. Обратная гираза
1.4.4. ДНК-топоизомераза III из термофильных архебактерий (Dam topo III)
1.4.5. Эукариотическая ДНК-топоизомераза III
1.5. ДНК-топоизомеразы подкласса IB
1.5.1. Топоизомераза 1 вируса оспы
1.5.2. Эукариотическая ДНК-топоизомераза I
1.5.2.1. ДНК-топоизомераза I человека
1.5.2.1.1. Структура ДНК-топоизомеразы I человека
1.5.2.1.2. Структура ДНК в комплексе с топоизомеразой I
1.5.2.1.3. Комплекс топоизомеразы 1 человека с ДНК
1.5.2.1.4. Линкерный домен topo I
1.5.2.1.5. Активный центр фермента
1.5.2.1.6. Механизм реакции топоизомеризации
1.5.3. ДНК-топоизомераза V
1.6. Биологические функции ДНК-топоизомераз
1.6.1. Репликация
1.6.2. Транскрипция
1.6.3. Другие биологические функции
1.6.4. Регуляция ДНК-топоизомеразы I
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Реактивы и материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Олигонуклеотиды
2.1.3. Неприродные олигопептиды
2.1.4. Ферменты
2.1.5. Буферы и среды
2.2. Методы
2.2.1. Выделение ДНК топоизомеразы I из плаценты человека
2.2.1.1. Получение грубого экстракта из плаценты
2.2.1.2. Фракционирование осаждением сульфатом аммония
2.2.1.3. Фракционирование белков с использованием гидроксиапатита
2.2.1.4. Хроматография топоизомеразы I на гепарин-сефарозе
2.2.1.5. Хроматография топоизомеразы I на фенил-сефарозе
2.2.1.6. Электрофоретический анализ белков
2.2.2. Выделение суперскрученной ДНК плазмиды
2.2.2.1. Выращивание клеток и получение грубого лизата, содержащего ДНК плазмиду
2.2.2.2. Очистка суперскрученной ДНК плазмиды на колонке (ДАСЕ1Ч-1тр
2.2.3. Получение мономера для фосфитамидного синтеза олигонуклеотидов, содержащих модельный АП-сайт - 1,4-ангидро-2-дезокси-0-рибитол
2.2.3.1. Синтез 1,4-ангидро-2-дезокси-0-рибитола (3)
2.2.3.2. Получение 5-0-(4,4’-диметокситретил)-1,4-ангидро-2-дезокси-Н-рибитола (4)
2.2.3.3. Получение 5-0-(4,4’-диметоксптретил)-1,4-ангидро-2-дезокси-0-рибитол-3-(2-цианэтил)-М.М-диизопропилфосфорамидита (5)
2.2.4. Очистка олигонуклеотидов
2.2.5. Очистка сШМР
2.2.6. Получение Р32-меченых олигонуклеотидов с помощью Т4 полинуклеотидкиназы

2.2.7. Отжиг комплементарных цепей олигонуклеотидов
2.2.8. Расчет концентраций олигонуклеотидов
2.2.9. Условия определения топоизомеразной активности
2.2.10. Определение кинетических и термодинамических параметров взаимодействия топоизомеразы I с различными ДНК-лигандами
2.2.11. Предынкубация топоизомеразы I с олигонуклеотидами
2.2.12. Очистка и определение концентрации тиазолсодержащих олигопептидов
2.2.13. Условия для количественного определения степени связывания тиазолсодержащих олигопептидов с олигонуклеотидными дуплексами
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение ДНК-топоизомсразы 1 из плаценты человека
3.2. Определение термодинамических параметров, характеризующих сродство топоизомераз к различным олигонуклеотидам
3.3. Особенности кинетического анализа реакции топоизомеризации
3.3.1. Определение типа ингибирования
3.4. Взаимодействие topo 1 мыши и человека с ДНК
3.4.1. Подходы к изучению механизмов узнавания ДНК в случае ДНК-зависимых ферментов
3.4.2. Типы взаимодействий, реализующиеся при узнавании ДНК различными белками и ферментами
3.4.3. Взаимодействие топоизомеразы I мыши с нсспецифическими олигонуклеотидами
3.4.4. Взаимодействие топоизомеразы I человека с неспецифическими олигонуклеотидами
3.4.5. Характер неспецифических взаимодействий в случае ДНК-топоизомераз
3.4.6. Взаимодействие топоизомераз с неспецифическими дуплексами
3.4.7. Взаимодействие топоизомераз со специфическими олигонуклеотидами
3.4.8. Взаимодействие топоизомеразы I с двухцепочечными олигонуклеотидами
3.4.9. Сравнение взаимодействия топоизомеразы I со специфическими и неспецифическими олигонуклеотидами

Предпочтительное связывание сс ДНК эукариотической topo I объясняется ее способностью более эффективно связывать фрагменты ДНК, содержащие участки изогнутости (curvature) [88, 96] или два отдельных ДНК-сегмента одновременно [93, 97]. Второе предположение основано на результатах, полученных с помощью электронной микроскопии, указывающих на взаимодействие topo I с дуплексом в участках пересечения цепей ДНК [97].
Оптимальная последовательность, необходимая для связывания и расщепления
ДНК эукариотической топоизомеразой I, определялась из сравнительного анализа
различных сайтов ДНК, расщепляемых ферментом [98, 99]. Такие участки довольно
часто встречаются в ДНК, и топоизомераза не проявляет абсолютной специфичности по
отношению к узнаваемой последовательности. Однако, несмотря на это, существуют
участки, более эффективно расщепляемые белком. Так ДНК-мотив:
А А ААА
5’-АААААА ACTTAG ААА -3’
G G ТТТ
прочно ассоциирован с топоизомеразой I in vivo [100, 101, 102] и с высоким сродством
связывается с ферментом in vitro. Скорость реакции при расщеплении в таких участках
на три порядка превышает скорости реакции в среднем по другим, расщепляемым topo I
последовательностям ДНК [103, 104].
Согласно данным нуклеазного расщепления и химического футпринтинга, эукариотическая topo I защищает от гидролиза обе цепи связанной ДНК на участке 15-19 нуклеотидов, при этом сайт расщепления расположен примерно в центре защищенного фрагмента ДНК [105].
Для расщепления ДНК необходимо взаимодействие topo I с двумя участками дуплекса. Как показано ниже, первый расположен в 5’-концевой части расщепляемой ссДНК (участок А), и второй (3’-концевой) предназначен для связывания цепи, содержащей 5’-гидроксильный конец ДНК после ее расщепления (участок В) [106].
точка расщепления I
-10-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 2 3 4 5 6 7 8
-TAAAAGACTTAGAAAAATT
-А т -у т т с т G А А Т С Т Т Т Т Т А А А В
Минимальная длина участка сс ДНК, необходимого для ее узнавания и протекания реакции расщепления составляет 9 и 5 оснований на расщепляемой и нерасщепляемой цепях соответственно [107] (обозначены на последовательности жирным шрифтом).