Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии и автоматического метода Эдмана при исследовании первичной структуры фактора элонгации EF-G

• Автор: Винокуров, Леонид Михайлович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 105 c. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУШ. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ПЕПТВДОВ

И БЕЛКОВ.

ГЛАВА I. КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ. ОСНОВНЫЕ

ПОЛОЖЕНИЯ ТЕОРИИ ХРОМАТОГРАФИИ

I. Оптимальные условия хроматографического разделения . 7 ГЛАВА П. ГЕЛЬПРОНИКАНЦАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ.

1. Стационарные фазы для высокоэффективной гельпроникащей хроматографии .

1.1. Неорганические поверхностномодифицированные носители.

1.2. Жесткие органические носители для гельпроникащей хроматографии.

2. Свойства носителей для гельпроникащей хроматографии . . ГЛАВА Ш. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
1. Носители для ионообменной хроматографии .
1.1. Ионообменники с органической полимерной матрицей .
1.2. Поверхностномодифицированные неорганические ионообменники .
2. Буферные системы для ионообменной хроматографии. Методы воздействия на хроматографическое разделение белков . . .
3. Практическое применение высокоэффективной ионообменной хроматографии
3.1. Разделение изоферментов
3.2. Разделение гемоглобинов .
ГЛАВА 1У. ОБРАТНОФАЗНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
1. Методы получения обратнофазных носителей
2. Общая характеристика обратнофазных носителей
3. Влияние диаметра пор матрицы и процентного содержания утлерода на разделение белков методом обратнофазной хроматографии
4. Сольвофобная хроматография на обратнофазных носителях. . .
5. Ионпарная хроматография
5.1. Ионпарная хроматография пептидов и белков.
6. Буферные системы для обратнофазной хроматографии
6.1. Буферные системы для разделения пептидов и белков .
ГЛАВА У. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ОБРАТНОФАЗНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.
1. Применение обратнофазной хроматографии при исследовании гомологичных белков
2. Применение высокоэффективной хроматографии при исследовании структуры белков .
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
I. МАТЕРИАЛЫ.
П. МЕТОДЫ .
Ш. Разделение пептидов бромцианового расщепления фрагмента Т5 обратнофазной хроматографией
IV. Разделение продуктов гидролиза Сгфактора трипсином по остаткам аргинина .
V. Выделение пептидов избирательным связыванием с инертным носителем .
УТ. Блокирование первичных аминогрупп пептидов фдуорескамином .
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛАВА I. РАЗДЕЛЕНИЕ БРОМЦИАНОВЫХ ПЕПТВДОВ ФРАГМЕНТА Т5 ФАКТОРА ЭЛОНГАЦИИ ЕРб МЕТОДАМИ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ .
ГЛАВА П. РАЗДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИЗА ЕРб ТРИПСИНОМ ПО ОСТАТКАМ АРГИНИНА МЕТОДОМ ОБРАТНОФАЗНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
ГЛАВА Ш. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЕПТВДОВ ПУТЕМ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ С
ТВЕВДОФАЗНЫМ НОСИТЕЛЕМ.
ГЛАВА ГУ. АВТОМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПЕПТВДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ПОСЛЕ РАСЩЕПЛЕНИЯ ЕРб ПО СВЯЗИ АврРго. БЛОКИРОВАНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ ФЛУЯЕСКАМИНСМ. ГЛАВА У. РЕКОНСТРУКЦИЯ СЕКЕЕНАТОРОВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ, ЭФФЕКТИВНОСТИ И НАДЕЖНОСТИ АВТОМАТИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ПО
ЭДМАНУ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В результате проделанной работы разработана схема разделения бромциановых и триптических пептидов методом ВЭЖХ, выделены бромциановые пептиды фрагмента Т5 и ряд пептидов из триптического гидролизата фактора элонгации , одного из крупнейших белковых компонентов системы трансляции . Автоматическим методом Эдмана установлены Яконцевые аминокислотные последовательности в пептидах, выделенных методом ВЭЖХ. Методом избирательного связывания выделен ряд пептидов фактора элонгации и установлена их аминокислотная последовательность. Путем реконструкции жидкостного и твердофазного секвенаторов повышена надежность и чувствительность определения аминокислотных последовательностей. Разработанные методы и приемы позволили получить значительную информацию при реконструкции полной аминокислотной последовательности молекулы фактора элонгации . В последнее время опубликовано несколько прекрасных обзоров 1, посвященных различным проблемам разделения биологически активных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В настоящем обзоре литературы рассмотрены наиболее общие свойства носителей и подвижных фаз для высокоэффективной хроматографии, и практическое применение этого метода для разделения микроколичеств пептидов и белков. I. Классификация хроматографических методов. Любое хроматографическое разделение возможно, когда подвижная фаза вместе с которой перемещается разделяемое вещество, может быть газообразной или жидкой. В случае, если подвижная фаза газ, метод носит название газоадсорбционной хроматографии, если же подвижная фаза жидкость, то это жидкостная хроматография. Жидкостную хроматографию можно классифицировать по способу разделения на несколько видов адсорбционную, ионообменную II, ситовую или гельпроникающую и обратнофазную . Для простых соединений, разделяющихся цри прохождении через колонну, происходит взаимодействие как со стационарной, так и с подвижной фазами . Степень удерживания вещества в неподвижной и подвижной фазах может быть охарактеризована коэффициентом распределения К. Отношение двух коэффициентов при постоянных внешних условиях является мерой селективности разделительной колонки. Знание числа эффективных теоретических тарелок для одного типа носителя позволяет провести сравнение разделяющей способности двух или нескольких колонок. Наиболее подробно общая теория жидкостной хроматографии, и в частности, высокоэффективной хроматографии, изложена в ряде обзоров ,. Оптимальными условиями разделения считаются такие условия, при которых удается добиться максимального разрешения при наименьшей затрате времени. Для данного типа носителя свойства разделительной колонки, а, следовательно, и оптимальные условия разделения, зависят как от способа заполнения колонки, так и от диаметра используемых частиц . Влияние температуры на условия и время разделения сказывается только косвенно , так как с увеличением температуры снижается вязкость элюента, что приводит к увеличению скорости элюента при постоянном давлении. Кроме того, температура влияет на кинетику и термодинамику удерживания вещества. Характерной особенностью высокоэффективной хроматографии является специфическое требование, предъявляемое к стационарным носителям, так как для достижения максимально возможного числа теоретических тарелок необходимы носители с малым диаметром частиц, оказывающих значительное сопротивление потоку элюента. В силу этого, стационарные фазы для ВЭЖХ должны быть устойчивы к действию давления. Теоретически, гельпроникаицая хроматография наиболее простейший и предсказуемый хроматографический метод. Поскольку пористые тела характеризуются удельной поверхностью, объемом и диаметром пор, то хроматографическое разделение макромолекул на таких носителях происходит за счет распределения молекул между подвижной и стационарной жидкостью, т. Теория хроматографического процесса разделения подробно изложена в ряде книг и обзорных статьях ,, . П.1. Для высокоэффективной жидкостной хроматографии необходимы фазы с твердой матрицей, преимущество которых заключено в том, что они не набухают, легче заполняются колонки с большим числом теоретических тарелок, обеспечивая при этом высокую проницаемость носителя независимо от давления. Разделение на таких фазах возможно с любым видом элюента.