Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp.

• Автор: Сильченко, Артем Сергеевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Фукоиданы бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Общие сведения

2.2 Классификация фукоиданов

2.2.1 Фукоиданы, построенные из я-1—>3-связанных остатков сульфатированиой L-фукозы
2.2.2 Фукоиданы, построенные из а-1—>3- и а-1—>4-связанных остатков сульфатированиой L-фукозы

2.2.3 Фукоиданы сложного состава. Галактофуканы

2.2.4 Фукансульфаты иглокожих

2.3 Фукоиданазы. Общая информация

2.3.1 Номенклатура и классификация фукоиданаз
2.3.2 Методы определения фукоиданазной активности
2.3.2.1 Колориметрические методы
2.3.2.2 Физико-химические методы
2.3.3 Распространение фукоиданаз
2.3.4 Выделение и очистка фукоиданаз
2.3.5 Физико-химические свойства фукоиданаз
2.3.6. Тип действия и специфичность фукоиданаз
2.3.7 Структура фукоиданаз
2.3.8 Индукция биосинтеза фукоиданаз в микроорганизмах
2.4 Альгиновые кислоты
2.4.1 Структура альгиновых кислот
2.6 Альгинат-лиазы
2.6.1 Номенклатура и классификация альгинат-лиаз
2.6.2 Методы регистрации альгинолитической активности
2.6.3 Распространение альгинат-лиаз
2.6.4 Альгинат-лиазы бактерий
2.6.5 Альгинат-лиазы грибов, бактериофагов и вирусов
2.6.6 Альгинат-лиазы беспозвоночных и морских водорослей
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Методы поиска продуцентов фукоиданаз среди бактерий
3.2 Фукоиданазы морской бактерии Formosa algae КММ 3553Т
3.2.1 Влияние различных углеводных компанентов питательной среды на биосинтез фукоиданаз в морской бактерии F. algae КММ 3553Т
3.2.2 Выделение и характеристика свойств фукоиданазы из морской бактерии
F. algae КММ 3553Т
3.2.3 Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз F. algae КММ 3553Т (Биоинформационный анализ фукоиданаз)
3.2.4 Получение рекомбинантных фукоиданаз F. algae КММ 3553Т
3.3 Фукоиданаза из морского моллюскаLambis sp
3.4 Альгинат-лиазы морской бактерии F. algae и морского моллюска Lambis sp
4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1 Материалы и реагенты
4.3 Методы исследования
5 ВЫВОДЫ
6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение Б
Приложение В
Приложение Г

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
А.о. - аминокислотный остаток
БСА (BSA) - бычий сывороточный альбумин
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография
ДМСО (DMSO) - диметилсульфоксид
ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия
ДТТ (DTT) - дитиотреитол
ДЭАЭцеллюлоза (DEAE-cellulose) - диэтиламиноэтил-целлюлоза ИПТГ (IPTG) - изопропил-/?-0-1-тиогалактопиранозид
МАЛДИ (MALDI) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация
ПААГ-электрофорез (PAGE) - электрофорез в полиакриламидном геле
ПСА (APS) - персульфат аммония
Р.И. - рефрактометрический индекс
ТФУ (TFA) - трифторуксусная кислота
УФ (UV) - ультрафиолетовое излучение, ),-280-320нм
ЯМР (NMR) - ядерный магнитный резонанс
Fuc - фукоза
Gal - галактоза
Glc - глюкоза
Man - манноза
Rha - рамноза
U - уроновая кислота
Ху1 - ксилоза
Подобным механизмом гидролиза обладают эндо-ламинариназы, выделенные из морских беспозвоночных. В продуктах их действия на ламинаран, помимо ламинариолигосахаридов, в значительных количествах присутствует глюкоза [109].
Фукоиданазная активность была обнаружена в пищеварительном тракте морского двустворчатого моллюска Pecten mctximus. Неочищенный препарат фермента катализировал деполимеризацию фукоидана из A. nodosum, уменьшая его молекулярную массу от 25 до 3 кДа [110]. Полученные олигосахариды содержали как а-1—»3-, так и а-1 —>4-связанные остатки L-фукозы. Сульфатные группы в этих олигосахаридах были присоединены по С2 и, возможно, по С4 положениям остатков фукозы. В данной фракции также содержались несульфатированные а-1—>3- и а-1—>4-связанные остатки L-фукозы. Впоследствие фермент из P. mctximus был выделен в гомогенном состоянии. Исследования его специфичности показали, что фермент способен отщеплять несульфатированную фукозу от природных фукоолигосахаридов, не проявляя специфичности к типу гликозидной связи. Авторы классифицировали данный фермент как a-L-фукозидазу (КФ 3.2.1.51) [106].
Экзо-фукоиданаза, выделеная из морского ежа S. midus, катализировала отщепление сульфатировапной по С2 фукозы от синтетического субстрата 2-сульфо-а-Ь-фукопиранозил-(1—>2)-пиридиламинид-фукозы [102].
При действии щелочной фукоиданазы из L. sitkana (оптимум pH 8,5) на фукоидан из F. evanescens [92] выход низкомолекулярных сульфатированных продуктов (12>и>2) оказался в три раза выше, чем при действии на него кислой формы фукоиданазы (оптимум pH 5,4). Под действием кислой фукоиданазы на фукоидан из S. cichorioides образуется в 3 раза меньше низкомолекулярных сульфатированных продуктов (12>и>2), чем при гидролизе фукоидана из F. evanescens [111]. Это может быть связано с различной степенью сульфатирования фукоиданов, а следовательно с большей доступностью для фермента О-гликозидных связей в низкосульфатированном фукоидане из F. evanescens по сравнению с высокосульфатированным фукоиданом из
S. cichorioides.
Для установления специфичности щелочной фукоиданазы из L. sitkana авторы [38] получили продукты расщепления фукоидана из F. evanescens. Использованная в этой работе в качестве субстрата фракция фукоидана из F. evanescens отличалась от ранее описанной Билан и сотр. [37]. По данным метилирования в этом фукоидане 1—>3-связей