Разработка новых металл-аффинных сорбентов, содержащих железо(III), для решения задач фосфопротеомики

• Автор: Гладилович, Владимир Дмитриевич
• Шифр специальности: 02.00.11, 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 116 с. : ил.

Содержание
Введение

Актуальность темы

Научная новизна работы

Практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Публикации

Благодарности

1 Обзор литературы

1.1 Металл-аффинная хроматография
1.1.1 Общие сведения и принцип действия метода металл-аффинной хроматографии
1.1.2 Сорбенты для металл-аффинной хроматографии
1.1.3 Использование металл-аффинной хроматографии в протеомных и фосфопротеомных исследованиях
1.2 Фосфопротеомный масс-спектрометрический анализ
1.3 Пленки Ленгмюра-Блоджетт
1.3.1 Основные задачи, решаемые с помощью метода Ленгмюра-Блоджетт
1.3.2 Выбор концентрации соли металла в водной субфазе при получении
пленок Ленгмюра-Блоджетт стеариновой кислоты
1.3.3 Изотермы сжатия пленок Ленгмюра-Блоджетт, содержащих железо(Ш)
Цели и задачи исследования
2 Материалы и методы
2.1 Материалы
2.2 Получение и структурные свойства сорбентов
2.2.1 Получение металл-хелатного сорбента (МХС)
2.2.2 Определение доли перехода кислоты в соль
2.2.3 Установление структурного звена МХС
2.2.4 Атомно-силовая микроскопия
2.2.5 Сканирующая электронная микроскопия
2.2.6 Стандартизация МХС
2.2.7 Определение влажности МХС

2.2.8 Синтез металл-оксидного сорбента (МОС)
2.2.9 Определение фазового состава МОС
2.2.10 Исследование сорбции фосфорилированного пептида на МОС
2.3 Электрокинетические исследования сорбентов
2.3.1 Определение электрокинетического потенциала МХС методом
потенциала течения
2.3.2 Определение электрокинетического потенциала МХС методом
микроэлектрофореза
2.3.3 Определение электрокинетического потенциала МХС и МОС
2.4 Определение удельной поверхности сорбентов
2.4.1 Определение удельной поверхности МХС
2.4.2 Определение удельной поверхности МОС методом низкотемпературной
адсорбции азота
2.4.3 Определение удельной поверхности МОС методом адсорбции красителей
2.5 Исследование изотерм сорбции и сорбционной емкости сорбентов
2.5.1 Определение сорбционной емкости сорбентов по белку
2.5.2 Расчет термодинамических характеристик сорбции белка
2.5.3 Определение сорбционной емкости сорбентов по пептиду
2.5.4 Расчет термодинамических характеристик сорбции пептидов
2.5.5 Определение специфичности сорбции на сорбентах
2.6 Металл-аффинная хроматография
2.6.1 Металл-аффинная хроматография фосфорилированного пептида для
оптимизации десорбции
2.6.2 Металл-аффинная хроматография смеси фосфоршшрованных и
нефосфорилированных пептидов
2.6.3 Металл-аффинная хроматография триптического гидролизата казеина
2.6.4 Металл-аффинная хроматография гидролизата клеточного лизата НеЬа
2.6.5 Металл-аффинная хроматография пептидов модифицированного зарином
альбумина человека
2.7 Масс-спектрометрический и хроматографический анализ
2.7.1 Качественный масс-спектрометрический анализ методом МАЛДИ
2.7.2 Количественный хроматографический анализ методом ВЭЖХ-УФ
2.7.3 Количественный хромато-масс-спектрометрический анализ методом
ВЭЖХ-МС
2.7,4 Качественный хромато-масс-слектрометрический анализ методом
наноВЭЖХ-МС
Результаты и обсуждение
3.1 Разработка металл-аффинного сорбента на основе пленок Ленгмюра-Блоджетт, состоящих из стеарата железа(Ш)
3.1.1 Получение пленок Ленгмюра-Блоджетт на основе стеарата железа(Ш)
3.1.2 Исследование структурных звеньев ПЛБ на основе стеарата железа(Т11)
3.1.3 Стандартизация ПЛБ на основе стеарата железа(Ш)
3.1.4 Микроскопические исследования ПЛБ на основе стеарата железа(Ш)
3.1.5 Исследование процесса сорбции фосфорилированного белка на ПЛБ на основе стеарата железа(Ш) методом атомно-силовой микроскопии
3.1.6 Определение влажности ПЛБ на основе стеарата железа(Ш)
3.2 Разработка металл-аффинного сорбента на основе оксида железа(Ш)
3.2.1 Получение оксида железа(Ш)
3.2.2 Определение фазового состава оксида железа(Ш)
3.2.3 Определение размеров частиц оксида железа(Ш)
3.2.4 Исследование сорбции фосфорилированного пептида на оксиде
железа(Ш) методом МАЛДИ масс-спектрометрии
3.3 Сравнение поверхностных свойств сорбентов
3.3.1 Определение электрокинетического потенциала МХС
3.3.2 Определение электрокинетического потенциала МОС
3.3.3 Определение удельной поверхности МХС Ре(Ш)
3.3.4 Определение удельной поверхности МОС Ре(Ш) методом низкотемпературной адсорбции азота
3.3.5 Определение удельной поверхности МОС Ее(Ш) методом адсорбции красителя
3.4 Сравнение сорбционных свойств сорбентов
3.4.1 Сорбция белка на МХС Ре(Ш)
3.4.2 Сорбция белка на МОС Ре(Ш)
3.4.3 Термодинамические характеристики сорбции белка
3.4.4 Определение сорбционной емкости МХС Ре(Ш)
3.4.5 Определение сорбционной емкости МОС Ре(Ш)
3.4.6 Изучение специфичности сорбции пептидов, фосфорилированных по различным аминокислотам
3.4.7 Термодинамические характеристики сорбции пептидов

промыли 50 мкл ацетонитрила и лиофилизировали. Затем навеску 6 мг растворили в 50 мл дистиллированной воды для получения концентрации 120 мг/мл. Приготовленный раствор использовали для построения калибровочного графика.
б) Приготовление растворов. 10 мг красителя Кумасси растворили в 5 мл 96% этанола, добавили 10 мл 85% ортофосфорной кислоты, перемешали, объем раствора довели дистиллированной водой до 100 мл и отфильтровали через плотный бумажный фильтр. Для построения калибровочного графика стандартный раствор казеина (120 мг/мл) растворили в 20 мМ трис-буфере с pH 7.4, содержащем 10 мМ ЭДТА.
в) Получение данных для калибровочного графика. К 250 мкл раствора с различной концентрацией белка (0, 20, 40, 60, 80, 100, 120 мкг/мл) добавили 1.25 мл реактива Кумасси и перемешали. Через 2 минуты измерили поглощение раствора при длине волны 595 нм против соответствующего контроля.
г) Построение изотермы адсорбции. В микропробирки внесли 100 дм2 МХС БеДИ) или 10 мг МОС Ре(Ш), добавили 100 мкл ацетонитрила, центрифугировали 2 минуты при 5000 об/мин, супернатант отбросили. Затем сорбент промыли 100 мкл 0.1% водного раствора ТФУ, супернатант после центрифугирования 2 минут при 5000 об/мин также отбросили. После этого в микропробирки добавляли 500 мкл (300 мкл в случае МОС) раствора белка с различной концентрацией и перемешивали в течение 30 минут. Далее растворы центрифугировали и отбирали по 250 мкл супернатанта, к которому добавляли 1.25 мл реактива Бредфорд и измеряли поглощение при длине волны 595 нм против соответствующего контроля. Концентрацию белка, не связавшегося с сорбентом, рассчитывали по ранее построенному калибровочному графику. По полученным данным по концентрации белка была рассчитана величина адсорбции Г:
Г* Садс‘Г/(Ш'Мказеина)? 04)
где Г - количество белка, поглощенного сорбентом [мкмоль/г]; Стс - концентрация белка, связавшегося с сорбентом [мкг/мл]; V - объем раствора, отобранного на анализ [мл]; т- масса сорбента [г]; Мказеина - молекулярная масса казеина [г/моль].
2.5.2 Расчет термодинамических характеристик сорбции белка
В микропробирки внесли 100 дм2 МХС БеДП) или 10 мг МОС БеДИ), добавили 100 мкл ацетонитрила, центрифугировали 2 минуты при 5000 об/мин, супернатант