Новые подходы к обнаружению физиологически активных компонентов женьшеня методом высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрии

• Автор: Ставрианиди, Андрей Николаевич
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 202 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список используемых сокращений

Введение

Глава 1. Литературный Обзор

1.1 Виды женыненей

1.2 Химический состав женьшеня

1.3 Извлечение гинсенозидов из растительного сырья

1.4 Выделение биоактивных компонентов женьшеня

1.4.1 Препаративная хроматография

1.4.2 Имунноаффинная хроматография

1.5 Определение целевых аналитов

1.5.1 Определение гинсенозидов методом ТСХ
1.5.2 Определение компонентов женьшеня методом ГХ
1.5.2 Определение состава женьшеня методом мицеллярной электрокинетической хроматографии
1.5.3 Определение состава женьшеня методом ВЭЖХ в сочетании с различными способами детектирования
1.5.4 Определение состава женьшеня методом ИФА
1.5.5 Определение состава женьшеня методом многомерной хроматографии
1.6 Групповая идентификация и определение метаболических профилей
1.7 Альтернативные способы определения состава женьшеня
1.8 Исследования метаболизма гинсенозидов
1.9 Актуальные задачи исследования женьшеня
1.9.1 Идентификации видов женьшеня
1.9.2 Оценка качества женьшеневой продукции
1.9.3 Получение информации о структуре метаболитов гинсенозидов в режиме on-line
1.9.4 Изучение динамики химической трансформации женьшеневых сапонинов
1.9.5 Фармакокинетические исследования женьшеневых сапонинов
Глава 2. Оборудование, материалы, техника эксперимента
2.1 Оборудование и материалы
2.2 Техника эксперимента
2.2.1 Схема эксперимента по оптимизации ВЭЖХ-МС дететктирования гинсенозидов
2.2.2 Схема эксперимента по разработке способа ультразвуковой экстракции гинсенозидов из растительного материала и продуктов на основе женьшеня
2.2.3 Схема эксперимента по по получению гинсенозидных профилей растительного материала и продуктов на основе женьшеня

2.2.4 Схема эксперимента по препаративному ВЭЖХ выделению фракции неизвестного сапонина из чая на основе женьшеня
Глава 3. Разработка способов обнаружения и определения гинсенозидов
3.1 Разработка способов определения гинсенозидов методом ВЭЖХ-МС/МС
3.1.1 Разработка способов детектирования гинсенозидов в режиме регистрации выбранных ионных переходов
3.1.2 Разработка способов определения псевдогинсенозидов в режиме регистрации выбранных ионных переходов
3.1.3 Выбор условий ВЭЖХ-МС детектирования гинсенозидов в режиме сканирования с использованием ЛИЛ
3.2 Разработка способов количественной оценки содержаний гинсенозидов
3.3 Разработка способов ультразвуковой экстракции гинсенозидов из растительного сырья и продуктов на основе женьшеня для ВЭЖХ-МС/МС анализа
3.3.1 Проверка применимости экстракции гинсенозидов способом «введено — найдено»
3.3.2 Сравнение хроматографических параметров разделения при использовании различных органических растворителей
3.3.3 Изучение эффективности извлечения гинсенозидов
Глава 4. Интерпретация масс-спектров гинсенозидов. Разработка способа групповой иденти фикации
4.1 Основные принципы интерпретации масс-спектров на примере стандартных гинсенозидов
4.1.1 Отличительные черты масс-спектров гинсенозидов
4.1.2 Примеры гинсенозидов, имеющих неотличимые масс-спектры
4.2 Алгоритм получения структурной информации из данных МС анализа образцов, содержащих женьшеневые сапонины
Глава 5 Апробация разработанного подхода обнаружения и определения гинсенозидов
5.1 Анализ объектов с использованием разработанного способа ВЭЖХ-МС/МС детектирования в режиме сканирования с использованием ЛИЛ
5.1.1 Анализ корней женьшеня
5.1.2 Анализ коммерческих продуктов на основе женьшеня
5.1.3 Классификация обнаруженных гинсенозидов по типу сапогенина
5.3 Определение псевдогинсенозидов в режиме регистрации выбранных ионных переходов
5.4 Исследование состава женьшеневого улуна
5.4.1 МС анализ женьшеневого улуна
5.4.2 Разработка способа полупрепаративного ВЭЖХ выделения компонентов женьшеневого чая
5.4.3 ЯМР анализ фракций, содержащих биоактивные компоненты женьшеневого улуна ....150 Литературный обзор

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БСА альбумин из бычьей сыворотки
ВП входной потенциал
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ВЭТСХ высокоэффективная тонкослойная хроматография
ГХ газовая хроматография
ДАС диссоциация, активированная соударением
ДМД диодноматричное детектирование
жх жидкостная хроматография
ЗЧАД детектирование заряженных частиц в аэрозоле
ИДСР испарительное детектирование по светорассеянию
ИФА иммуноферментный анализ
КЗЭ капиллярный зонный электрофорез
КЭ капиллярный электрофорез
ЛИЛ линейная ионная ловушка
МКАТ моноклональное антитело
МНК метод наименьших квадратов
мс масс-спектрометрия
мэкх мицеллярная электрокинетическая хроматография
мээкх микроэмульсионная электрокинетическая хроматография
ОАК олеаноловая кислота
от октилЛОЛ
ПАВ поверхностно-активное вещество
пд потенциал декластеризации
ПМР протонный магнитный резонанс
ппд протопанаксадиол
ппт протопанаксатриол
ПЦР полимеразная цепная реакция
сссх хроматография в сверхсжатом слое
СФЭ сверхкритическая флюидная экстракция
тех тонкослойная хроматография
УФ ультрафиолетовый
ХИАД химическая ионизация
эс энергия соударений
ЯМР ядерный магнитный резонанс

летнего растения женьшеня. Общие средние содержания гинсенозидов и полиацетиленов в корневых отростках оказались значительно выше, чем в основном корне. Применяя градиентное элюирование смесью ацетонитрил:вода:изопропанол на обращенно-фазовой аналитической колонке с аминными связями, удалось разделить гинсенозиды Rbl, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rgl, Rg2, Rg3 и Rhl [23]. Детектирование в элюате осуществлялось с помощью ИДСР и пределы обнаружения оказались на уровне 35-155 нг/г.
Более типичным является применение ВЭЖХ-МС для групповой идентификации гинсенозидов. Так, 25 гинсенозидов разделены с помощью градиентного элюирования на колонке С18 [117]. В качестве подвижной фазы выступала смесь 8 мМ ацетата аммония (pH 7) и ацетонитрила. Детектирование в элюате проводили с помощью ИДСР и ионной ловушки (MC-детектирование). В масс-спектрах простых сапонинов присутствовал сигнал депротонированной молекулы [М-Н]~, и ее аддуктов [М+АсО]~ и [М-СН20+АсО]~, и сильные сигналы двухзарядных аддуктов, например [М-Н+АсО]2" и [М+2АсО]2-. А спектры малонил-замещенных гинсенозидов из-за термической нестабильности содержали помимо ионов [М-Н]~, ионы [М-С02-Н]~, [М-С02+АсО]~, [М-С02-Н+Ас0|2~ и [М-С02+2Ас0]2“. МС/МС спектры для простых сапонинов соответствовали обычным паттернам фрагментации подобных соединений с последовательной потерей сахаридных остатков, в то время как спектры малонил-замещенных гинсенозидов содержали интенсивные сигналы, соответствующие потере малонил радикала. В работе [118] даны относительные интенсивности ионов [М-Н] 71 [М+О Ас] ”, I [М-2Н] 2_/I [М-Н+2 О Ас] 2~ и 1[М~Н+ОАс]271[М+ОАс]2~, и показано, как различия в этих интенсивностях связаны со структурой гинсенозидов, что может быть использовано для идентификации изомеров, а именно Rf, F-11 и Rgl, Rd и Re, Rb2 и Rc. Метод ВЭЖХ с ДМД и ИЭР-МС детектированием применяли для анализа экстрактов из азиатского и американского женыненей [119]. Разработанный способ подходил для разделения и одновременного определения основных найденных гинсенозидов в охлажденных льдом спиртовых экстрактах. Этот способ также подходит для обнаружения других соединений, которые часто встречаются в таких экстрактах из корня женьшеня. Более того, данный метод может быть применен для разделения и определения