Пространственная структура комплексов и механизм каталитического действия фермента SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Урусова, Дарья Владимировна
• Шифр специальности: 01.04.18
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Список употребляемых в диссертации сокращений

Глава 1. Литературный обзор

1 1. Биосинтез пуриновых нуклеотидов

1.2 SAICAR-синтаза Saccharomyces cerevisiae

1 2 1 Биохимические свойства фермента SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae

1 2 2 Пространственная структура SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae

1 2 3 Сравнение структуры SAICAR-синтазы с другими АТР-зависимыми ферментами цикла биосинтеза пуриновых нуклеотидов

Глава 2 Рентгеноструктурное исследование комплексов SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae

2.1 Получение и очистка фермента

2 2 Исследование комплекса (SS+ASP)

2 2 1. Получение кристаллов
2.2.2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений
2.2 3. Определение и уточнение структуры комплекса (SS+ASP) 26 2 2 4 Анализ качества модели
2 2 5 Структура комплекса (SS+ASP)
2 3 Исследование комплексов с аденозинтрифосфатом,
(SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II .
2 3 1 Получение кристаллов комплексов с аденозинтрифосфатом
2.3 2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений 35 2 3 3 Определение структуры комплексов с АТР
2 3.4 Анализ качества моделей. ..
2.3.5 Структуры комплексов (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II
2.4. Исследование комплекса с AICAR и янтарной кислотой (SS+AIC+SUC)
2.4.1. Получение кристаллов комплексов с A1CAR и янтарной кислотой
2.4.2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений
2.4 3 Определение структуры комплекса (SS+AIC+SUC)
2.4 4 Анализ качества модели
2 4 5 Структура комплекса (SS+A1C+SUC)
2.5. Исследование комплекса с аденозинтрифосфатом, AICAR и
янтарной кислотой (SS+ADP+AIC+SUC)
2 5.1 Получение кристаллов комплекса (SS+ADP+A1C+SUC)
2.5 2 Измерение интенсивностей дифракционных отражений.... 56 2 5 3 Определение структуры комплекса (SS+ADP+AIC+SUC)
2.5.4 Анализ качества модели
2.5.5. Структура комплекса (SS+ADP+AIC+SUC)
2.6. Исследование комплекса с SAICAR (SS+SAICAR)
2 6.1. Получение кристаллов комплексов с SAICAR
2.6 2 Измерение интенсивностей дифракционных отражений

2 6 3. Определение структуры фермент-субстратного комплекса
2 6 4. Анализ качества модели
2 6 5. Структура комплекса (SS+ SAICAR)
Глава 3 Сравнение пространственной структуры SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae с пространственными структурами SAICAR-синтаз Thermatoga maritima и Е coli
3.1. Сравнение с SAICAR-синтазой Thermatoga maritima
3.2. Сравнение с SAICAR-синтазой Е coli
Глава 4 Механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы
4.1. Предлагаемые модели механизмы каталитической реакции
SAICAR-синтазы
4 2. Каталитический механизм SAICAR-синтазы Saccharomyces
serevisiae
Основные результаты и выводы
Благодарности .. .
Список цитируемой литературы

Список употребляемых в диссертации сокращений
ADP, аденозиндифосфат;
AICAR, 5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеотид, или 5’-фосфорибозил-5-амино-4-имидазолкарбоксамид;
AIR, 5-аминоимидазолрибонуклеотид, или 5’-фосфорибозиламиноимидазол; АМР, аденозинмонофосфат;
ASP, L-аспарагиновая кислота, или L-аспартат;
АТР, аденозинтрифосфат;
CAIR, рибонуклеотид -5-аминоимидазол-4-карбоновой кислоты, или 5’-фосфорибозил-5-аминоимидазолкарбоксилат;
СТР, цитидинтрифосфат;
FGAM, фосфорибозил-формилглицинамидин;
FGAR, фосфорибозил-формилглицинамид;
GAR, глицинамидрибонуклеотид, или фосфорибозил-глицинамид;
GDP, гуанозиндифосфат;
GMP, гуанозинмонофосфат;
GTP, гуанозинтрифосфат;
IMP, инозинмонофосфат;
PRPP, 5-фосфорибозил-1 -пирофосфат;
R.M.S., среднеквадратичное отклонение;
SAICAR, сукцино-AICAR, или 5’-фосфорибозил-4-(Ы-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол;
SUC, янтарная кислота, или сукцинат;
THF, N5,14ш-метенил-ТГФК, или Мш-формил-тетрагидрофолиевая кислота; UTP, уридинтрифосфат;
TRIS, 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол, или трис-(гидроксиметил)аминометан.

электронная плотность и относительно высокие значения температурного фактора, что говорит о ее возможной подвижности. Поэтому координаты атомов аденинового основания не использовались при уточнении модели, тогда как атомы фосфатной группы и рибозного кольца в последних циклах уточнения были включены в модель вместе с атомами белка. В уточненной модели атомы кислорода фосфатной группы AICAR фиксированы водородными связями с аминокислотными остатками фермента Argl22, Seri 28 и Arg242, а рибозное кольцо образует водородную связь 0(2’)... 0(D2)Asp215 (Табл. 8).
Как было отмечено выше, второе место связывания AICAR в молекуле белка совпало с дополнительным местом связывания АТР в АТР-содержащих комплексах. Адениновое основание фиксировано водородными связями N(l)...OLeul08, N(l)...OVal77 и O(6)...NLeul08, рибозное кольцо образует одну водородную связь 0(2’)...0(El)Glu62, а атомы кислорода фосфатной группы связаны с белком единственным взаимодействием N(Z)Lys66...0(2A). Как и для АТР, для атомов AICAR температурный фактор возрастает от аденинового основания к фосфатной группе, выходящей в окружающий раствор (Рис. 13). Роль этого места связывания, как и в случае с АТР, пока не выяснена. Возможно, аналогичное связывание определяется структурным сходством их молекул, обеспечивающим образование одинаковых водородных связей.
Надо отметить, что сначала мы получили и исследовали комплекс с AICAR и аспарагиновой кислотой, однако увидеть все атомы аденинового основания A1CAR, равно как и аспарагиновой кислоты, нам не удалось. Предположив, что положительные заряды аминогрупп неприродного субстрата AICAR и природного субстрата аспарагиновой кислоты препятствуют правильному расположению этих молекул на местах истинных субстратов, мы заменили аспарагиновую кислоту янтарной, не имеющей аминогруппы. Результат получился лучше, но, к сожалению, не