Кислородные метаболиты в иммунном ответе насекомых

• Автор: Комаров, Денис Александрович
• Шифр специальности: 01.04.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 88 с. : ил.

1. Литературный обзор. Кислородные метаболиты в биологических системах

1.1. Молекулярные механизмы токсичности кислорода

1.2. Молекулярные механизмы токсичности хиноновых соединений

1.3. Методические подходы к изучению кислородных метаболитов в биологических системах

1.3.1. Регистрация супероксидного радикала

1.3.2. Регистрация перекиси водорода

1.3.3. Регистрация гидроксильного радикала

1.3.4. Регистрация семихиноновых радикалов. Метод спиновой стабилизации орто-семихинонов

1.4. Цитотоксические частицы в иммунном ответе насекомых

2. Материалы и методы

3. Экспериментальная часть. Цитотоксические интермедиаты процесса меланизации

3.1. Регистрация супероксидного радикала в процессе меланизации
3.2. Регистрация ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона в гемолимфе насекомых
3.3. Изучение взаимодействия ДОФА с супероксидным радикалом
3.4. Регистрация перекиси водорода в процессе меланизации
3.5. Регистрация гидроксильного радикала в гемолимфе насекомых
Заключение
Выводы
Благодарности
Список литературы
Приложение 1. Анализ спектра ЭПР комплекса ДОФА-семихинонового
радикала с Мд2+
Приложение 2. Список принятых сокращений
На сегодняшний день достоверно известно, что интермедиаты восстановления молекулярного кислорода до воды, такие как супероксидный радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал, принимают участие в иммунных реакциях многих живых организмов в качестве цитотоксических частиц против патогенных организмов. В литературе обсуждается также возможность участия кислородных метаболитов в иммунных реакциях насекомых. Однако существующие на сегодняшний день исследования в этой области ограничиваются лишь единичными работами, которые не позволяют сделать однозначный вывод об образовании и участии этих частиц в защитных реакциях насекомых.
Актуальность проблемы. Одним из основных механизмов защиты насекомых является процесс инкапсуляции, во время которого вокруг патогенного организма происходит формирование меланиновой капсулы. Ключевой фермент меланизации, фенолоксидаза, окисляет тирозин до 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и далее до соответствующего ДОФА-хинона. Цепь последующих превращений приводит к образованию нерастворимого полимера меланина. Предполагается, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием потенциально токсичных семихиноновых радикалов, в частности ДОФА-семихинонового радикала. Однако до сих пор не существует экспериментальных доказательств образования этих частиц в процессе меланизации у насекомых. Некоторые исследователи полагают, что гипотетические семихиноновые интермедиаты меланизации могут взаимодействовать с молекулярным кислородом, восстанавливая его до супероксидного радикала. Существует ряд работ, в которых сообщается об образовании супероксидного радикала в процессе меланизации у насекомых. В этих работах супероксидному радикалу приписывается роль цитотоксичной частицы, ответственной за разрушение чужеродного организма в процессе его инкапсуляции. Однако, так как авторы этих работ для
регистрации супероксидного радикала применили недостоверный метод, полученные ими результаты вызывают сомнения. С другой стороны существуют работы, в которых авторам не удалось зарегистрировать образование супероксидного радикала в процессе меланизации у насекомых.
Таким образом, на сегодняшний день не существует достоверных доказательств образования и участия супероксидного радикала в иммунных реакциях насекомых, и механизмы, приводящие к разрушению чужеродного материала в процессе иммунного ответа, остаются изученными недостаточно.
Основной целью настоящей работы являлось определение природы частиц, образующихся в процессе меланизации, которые могли бы выступать в качестве цитотоксических против патогенных организмов в процессе иммунного ответа насекомых. Для успешного выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Выяснить, сопровождается ли процесс меланизации у насекомых образованием супероксидного радикала.
2. Зарегистрировать образование семихиноновых радикалов в процессе меланизации у насекомых.
3. Изучить роль супероксидного и семихиноновых радикалов в иммунных реакциях насекомых.
Научная новизна. В настоящей работе впервые было показано, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием такой цитотоксической частицы, как ДОФА-семихиноновый радикал. Была изучена роль ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона в иммунном ответе насекомых.
Впервые было показано, что в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой происходит образование перекиси водорода. Зарегистрировать образование супероксидного радикала при окислении ДОФА фенолоксидазой прямыми методами не удалось. Однако, учитывая влияние супероксид дисмутазы на выход перекиси в этом процессе, был
ДОФА-семихинон в гемолимфе
ниже, чем в гемолимфе нативных насекомых, и равнялась стационарной концентрации ДОФА-семихинонового радикала, образующегося при автоокислении ДОФА в буфере.
1200

ш 1000

Е 600 £

О 400 т

н 200 х

Рис. 3.9 Влияние грибковой инфекции М. ап'1БорИа на образование ДОФА-семихинона при окислении ДОФА (10 мМ) в гемолимфе в. теНопеНа в присутствии 0.5 М Мд2+. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение (п = 5; * Р < 0.05).
Мы также сравнили генерацию ДОФА-хинона в гемолимфе нативных и инфицированных насекомых. Скорость образования ДОФА-хинона в гемолимфе измеряли по скорости окисления аскорбиновой кислоты (см. Материалы и методы, стр. 37). Как видно из рисунка 3.10 скорость образования ДОФА-хинона в гемолимфе инфицированных насекомых была в ~ 4 раза ниже, чем в гемолимфе нативных насекомых, и была равной скорости образования ДОФА-хинона при автоокислении ДОФА в буфере.
Вероятно, полученные результаты означают, что в процессе развития в организме насекомого грибок М. ап'15орИа выделяет в гемолимфу вещества, подавляющие активность фенолоксидазной системы. Заметим, что ранее уже сообщалось о пониженной активности фенолоксидазы в гемолимфе личинок б. теНопеНа, инфицированных М. ап/эорИа [132].
автоокисление нативные инфицированные