Создание и применение методов количественной протеомики с использованием и без использования изотопного мечения

• Автор: Агрон, Илья Александрович
• Шифр специальности: 01.04.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 87 с. : ил.

Содержание
Введение
Цель работы
Научная новизна работы
Практическая значимость работы
Личный вклад автора
Защищаемые положения
Структура диссертации
Список сокращений
Г лава 1. Методики качественной и количественной идентификации белков в
смесях с применением масс-спектрометрии
Развитие применения масс-спектрометрии в протеомике
Подходы к идентификации белков методами масс-спектрометрии,
существующие на данный момент
Peptide mass fingerprint
Подход bottom-up
Подход top-down
Секвенирование de novo
Метод точных массово-временных меток
Разрешающая способность и точность измерения масс
Масс-спектрометрия ИЦР ПФ
Подходы в количественной протеомике
Совмещение методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии.
Источники ионизации
Источник ионов на основе электрораспыления в вакуум
MALDI при атмосферном давлении
Источник MALDI при атмосферном давлении
APCI - химической ионизации при атмосферном давлении
Глава 2. База точных массово-временных меток для протеома мочи человека

Объект исследования

Методы исследования
Сбор образцов мочи
Подготовка проб для хромато-масс-спектрометрии
Хромато-масс-спектрометрия
Анализ данных и идентификация белков
Структура базы данных
Созданная база точных массово-временных меток для иротеома мочи
человека
Глава 3. Количественная протеомика
Пробоподготовка
Получение образцов мочи
Получение пептидов, меченных
Хромато-масс-спектрометрический эксперимент
Обработка результатов эксперимента
Выделение моноизотопных пиков однозарядных ионов
Поиск по АМТ-базе
Объединение результатов поиска
Корректировка интенсивностей пиков
Схема сравнительно-количественного анализа
Модельный эксперимент
Глава 4. Подход к совмещению методов атомно-силовой микроскопии и
масс-спектрометрии
Модельный эксперимент №
Модельный эксперимент №
Заключение
Список литературы
Приложения
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Введение
При помощи современных методов, основанных на масс-спектрометрическом анализе, можно исследовать биологические объекты самого разного происхождения и сложности. Это стало возможным благодаря открытию новых методов ионизации вещества: метода элсктроспрей и метода лазерной десорбции/ионизации из матрицы (МАЛДИ) — которые позволили переводить в газовую фазу и одновременно ионизировать большие биологические молекулы, такие как пептиды, белки и полинуклеотиды. Среди методов масс-спектрометрии, используемых в протеомных исследованиях, масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) занимает особое место. Главными достоинствами этого метода являются: сверхвысокая
разрешающая способность и рекордная точность измерения масс. С помощью современного масс-спектрометра ИЦР ПФ можно однозначно как идентифицировать индивидуальные биомолекулы, так и определять состав их смесей.
В настоящее время полностью расшифрованы геномы различных организмов, в том числе и человека. В связи с исследованиями многообразия белков, содержащихся в различных биологических объектах, возникла новая фундаментальная концепция, названная «протеом» (ПРОТЕиновое дополнение к генОМу). Создана новая дисциплина - протеомика, которая призвана дополнить и аннотировать информацию, содержащуюся в геномах. Современная масс-спектрометрия (в том числе, и ИЦР Г1Ф) занимает передовые позиции в решении основной задачи протеомики идентификация белков. В настоящее время также ведется активная разработка масс-спектрометрических методов количественного анализа протеомов.
Масс-спектрометр ИЦР ПФ обладает ограниченным динамическим диапозоиом, в то же время, протеомы различных организмов содержат белки в широком диапазоне относительных концентраций. И поэтому необходимо использовать масс-спектрометрии ИЦР ПФ в комбинации с существующими

измерений в динамических методах с целью их последующей количественной интерпретации, что является весьма полезным в фундаментальных исследованиях специфических взаимодействий антиген-антитело с помощью АСМ.
Источники ионизации
Важной частью работы являлось применение различных способов ионизации, благодаря открытию которых и удалось столь успешное развитие как количественной или качественной протеомики, так и совмещение методов АСМ и масс-спектрометрии. Ниже приведен литературный обзор методов ионизации: МА1Л}1 и Е81.
Источник ионов на основе элекгрораспыления в вакуум
Ионный источник элекгрораспыления в вакуум состоит из полой иглы (электроспрейной иглы), по которой подается раствор анализируемого вещества и. нагреваемого (десольватирующего) капилляра, расположенного на некотором расстоянии от электроспрейной иглы, который является входным элементом вакуумной системы масс-спектрометра. Между электроспрейной иглой и нагреваемым капилляром поддерживается разность потенциалов 1-5 кВ. Исследуемое вещество (или смесь исследуемых веществ) растворяется в растворителе, при этом стараются выбирать такие растворители, которые обеспечивают минимальное поверхностное натяжение. Дополнительно в раствор добавляют вещества, которые могут стать донорами носителейзарядов.Например, для ионизации органических веществ в источник ионизации электрораспылением в вакуум раствор исследуемого вещества подается при помощи насоса в электроспрейную иглу. Под воздействием электрического поля раствор в игле поляризуется и с кончика иглы срываются заряженные капли. После чего капли движутся в атмосфере, интенсивно испаряются, дробятся в результате кулоновского взрыва. Далее капли поступают в нагреваемый (десольватирующий) капилляр, который прогревается до температуры